研究生第八讲

合作建立了液体深层培养，成功地生产出青霉素，开创了抗生素的时代。随后是链霉素、卡那霉素、庆大霉素、红霉素等的相继出现，形成三大抗感染抗生素治疗的时代，产生了空前的医疗效果和巨大的经济效益。新的抗生素的寻找很快扩展到抗真菌、抗肿瘤的抗生素，以及具有抗细菌耐药性的新型抗生素，成为当代的研究热点。3抗生素的分类（根据结构分类）3.1β-内酰胺类抗生素—主要有青霉素类、头孢霉素类3.2氨基糖苷(环醇）类抗生素—主要有链霉素、卡那霉素、庆大霉素等。3.3四环类抗生素—主要有四环素、土霉素、金霉素、多西环素（强力霉素）等3.4大环内酯类抗生素—主要有红霉素、螺旋霉素等3.5蒽环类抗生素—主要有阿霉素、紫红霉素等；3.6安莎霉素类抗生素—主要有力复霉素、力复平等3.7多烯大环内酯类抗生素—主要有两性霉素B、制霉菌素、杀假丝菌素等3.8聚醚类抗生素—主要有莫能霉素、盐霉素等；3.9肽类抗生素—多粘菌素、杆菌肽等；3.10放线菌类抗生素：放线菌素D（更生霉素）

第二节青霉素生产工艺1青霉素的结构与抑菌机理青霉素和头孢霉素是β-内酰胺类抗生素的主要代表，β-内酰胺类抗生素是迄今为止已知抗生素中毒性最低、品种最多、临床上应用最广泛的一类抗生素。这类抗生素由一个四元β-内酰胺环和一个五元或六元的杂环通过N和相邻的C原子结合而成。

6-酰胺-2，2-二甲基青核-3-羧酸青霉素的化学名：6-酰胺-2，2-二甲基青核-3-羧酸，俗名：盘尼西林。β-内酰胺类抗生素的抑菌机理是：干扰细胞壁(肽聚糖)的合成。通过与转肽酶的作用，特异性地抑制细菌细胞壁肽聚糖的完整合成，并且只作用于生长中的细胞，对静止的细胞无效。对无细胞壁的动物不产生毒性。但是，这类化合物易和血浆蛋白结合，形成过敏。此外，β-内酰胺类抗生素长期使用细菌易产生抗药性。2青霉素的合成机制：青霉素、头孢霉素C合成的前体物质有半胱氨酸（cys)、缬氨酸(val)、α-氨基己二酸及苯乙酸等。

3个前体氨基酸由葡萄糖转化而成，首先在三肽合成酶（ACVS）的作用下，将它们缩合成三肽（LLD-ACV），然后由异青霉素N合成酶（IPNS）催化LLD-ACV氧化闭环（环化），生成异青霉素N（IPN），再与活化的侧链前体苯乙酰CoA或苯氧乙酰CoA将IPN转化成青霉素G或青霉素V（转酰基）。3青霉素生产工艺3.1青霉素生产菌种：经选育后的产黄青霉菌株。3.2孢子制备：为了获得丰富的高质量的孢子。产黄青霉活化斜面母瓶25

℃，6~7d

大米/小米孢子培养基（休眠孢子）接种

25

℃，6~7d米孢子3.3种子制备：目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够的菌丝。米孢子一级种子罐25

℃，1：2V/V

二级种子罐

40~45h接种10%

25

℃，1：1.5V/V

发酵罐

16

~18h接种20%

3.4培养基：3.4.1母斜面培养基：葡萄糖、蛋白胨、甘油；3.4.2孢子培养基：大米/小米3.4.3一级种子罐：葡萄糖、乳糖、玉米浆；3.4.4二级种子罐：葡萄糖、玉米浆3.4.5发酵培养基：碳源：葡萄糖；氮源：玉米浆、花生饼粉、棉籽饼粉、硫酸铵、尿素；前体：苯乙酸或苯乙酸铵（分多次加入）；无机盐：包括S、P、Ca、Mg、K等，Fe3+应严格地控制在30μg/ml以下。3.5发酵培养3.5.1温度控制：前期（60h前）25℃

~26℃，中期（60h后）23℃，后期适当升温。3.5.2pH控制：通过流加葡萄糖控制6.4~6.6，避免达到7.2，一般残糖降至0.6%左右、pH上升时开始加糖。3.5.3溶氧控制：通气比一般为1：0.8，溶氧不低于饱和溶氧的30%3.5.4补料：流加葡萄糖、硫酸铵、氨水、苯乙酸或苯氧乙酸、消泡剂(通常用豆油、玉米油或化学合成消泡剂）3.5.5周期：180h~240h

典型青霉素发酵过程曲线PVC-湿细胞体积PenG-效价DO-溶氧浓度Cs-残糖Cn-氨基氮浓度3.6青霉素下游提取工艺3.6.1发酵液的预处理：发酵液冷却到5℃左右，加絮凝剂絮凝，搅拌均匀。青霉素对酸、碱、热都不稳定，因此，要在低温环境下操作。3.6.2发酵液的固液分离：采用鼓式真空过滤器进行固液分离。3.6.3溶媒（BA）萃取：滤液用15%硫酸酸化至pH2~2.2，按1：3.5~1：4的量加醋酸丁酯（BA）抽提，静置，分离，得到一次BA提取液。3.6.4一次水提取：按1：4~1：5体积加入1.5%的NaHCO3缓冲液在pH6.8~7.0条件下将青霉素从BA液中反萃取到缓冲液中，得到一次水提取液。3.6.5二次溶媒（BA）萃取：再用15%硫酸将一次水提取液酸化至pH2~2.2，按1：3.5~1：4的量加醋酸丁酯（BA）二次抽提，静置，分离，得到二次BA提取液。3.6.6脱色：在二次BA提取液中加入活性炭（150~300g）/10亿单位，搅拌15~20分钟，过滤。3.6.7结晶：脱色液中加入25%KAC-丁醇溶液，在真空度>0.095MPa及45℃~48℃下共沸结晶，得结晶混合液，过滤（离心），先后用少量丁醇和BA各洗涤两次，得湿晶体和母液。3.6.8干燥：湿晶体在50℃，>0.095MP真空度下干燥约16h，然后磨粉，装桶，得青霉素工业盐。3.6.9回收：母液蒸馏回收，注意回收得率。二、酒精的工业生产

1、酒精生产原料

1.1薯类原料甘薯、木薯和马铃薯等。

1.2谷物原料玉米、高梁、大米和小麦等。

1.3糖类原料废糖蜜、甘蔗、甜菜等。

1.4野生植物原料椽子仁、土茯苓、楝树果等。

1.5纤维原料森林工业和木材加工工业的下脚料、农作物秸秆、甘蔗渣、废纤维垃圾和废纸浆等。

1.6其他原料亚硫酸纸浆废液、淀粉渣等。

2、生产菌种：

酒精酵母（Saccharomyces

cerevisiae):卵圆形、椭圆形，6～11微米，芽殖。一般采用活性干酵母。

发酵运动单胞菌（Zymomonasmobilis)：1911年从败坏的苹果酒中得到，运动性杆菌，G—厌氧。3、工艺过程（以玉米淀粉原料为例）3.1原料的预处理：除杂、粉碎3.2工艺流程糖化剂酵母原料→预处理→水热处理→糖化→发酵→蒸馏→酒精

CO2酒糟3.3水热处理（蒸煮、液化）3.3.1粉浆的制备3.3.2加热处理粉料+1：3～4水混合搅拌→预热（60℃

～70℃）→粗过滤

高温：135℃左右，45分钟（逐渐被淘汰）→蒸煮中温：105℃左右，加高温液化酶，45分钟

90℃液化，加中温液化酶，45分钟液化酶：α-淀粉酶3.4糖化蒸煮醪冷却到60

℃蒸煮醪+糖化酶保温50分钟

糖化醪冷却进发酵罐糖化酶：100～

150/g淀粉

3.5酒精发酵过程

3.5.1酒精发酵的基本理论酒精发酵作用，是酵母菌把可发酵性的糖，经过细胞内酒化酶的作用，生成了酒精与CO2，然后通过细胞膜将这些产物排出体外酒精是可以任何比例与水混合的，所以由酵母体内排出的酒精便溶于周围的醪液中。3.5.2间歇式发酵

酒精发酵过程（间歇式发酵法）从外观现象可以将其分为如下三个发酵不同阶段：a.前发酵期b.主发酵期c.后发酵期

a.前发酵期在酒母与糖化醪加入发酵罐后，醪液中的酵母细胞数还不多，由于醪液中含有少量的溶解氧和充足的营养物质，所以酵母菌仍能迅速地进行繁殖，使发酵醪中酵母细胞繁殖到一定数量。在这一时期，醪液中的糊精继续被糖化酶作用，生成糖分，但由于温度较低，故糖化作用较为缓慢。从外观看，由于醪液中酵母数不多，发酵作用不强，酒精和CO2产生得很少，所以发酵醪的表面显得比较平静，糖分消耗也比较慢。前发酵阶段时间的长短，与酵母的接种量有关。如果接种量大，则前发酵期短，反之则长。前发酵延续时间一般为l0小时左右。由于前发酵期间酵母数量不多，发酵作用不强，所以醪液温度上升不快。醪液温度控制，在接种时为26—28℃，前发酵期温度一般不超过30℃。如果温度太高，会造成酵母早期衰老，如果温度过低，又会使酵母生长缓慢。

前发酵期间应十分注意防止杂菌污染，因为此时期酵母数量少，易被杂菌抑制，故应加强卫生管理。

b．主发酵期

酵母细胞已大量形成，醪液中酵母细胞数可达1亿／毫升以上。由于发酵醪中的氧气也已消耗完毕，酵母菌基本上停止繁殖而主要进行酒精发酵作用。醪液中糖分迅速下降，酒精分逐渐增多。因为发酵作用的增强，醪液中产生了大量的CO2。随着CO2的逸出，可以产生很强的CO2泡沫响声。发酵醪的温度此时上升也很快。生产上应加强这一阶段的温度控制。根据酵母菌的性能，主发酵温度最好能控制在30—34℃主发酵时间长短，取决于醪液中营养状况，如果发酵醪中糖分含量高，主发酵时间长，反之则短。主发酵时间一能为12小时左右。

c．后发酵期

醪液中的糖分大部分已被酵母菌消耗掉，醪液中尚残存部分糊精继续被酶作用，生成葡萄糖。由于这一作用进行的极为缓慢，生成的糖分很少，所以发酵作用也十分缓慢。因此，这一阶段发酵醪中酒精和CO2产生得也少。后发酵阶段，因为发酵作用减弱，所以产生的热量也减少，发酵醪的温度逐渐下降。此时醪液温度应控制在30—32℃左右。如果醪液温度太低，糖化酶的作用就会减弱，糖化缓慢，发酵时间就会延长，这样也会影响淀粉出酒率。淀粉质原料生产酒精的后发酵阶段一般约需40小时左右才能完成。

3.5.3连续发酵糖化醪加入发酵罐首罐同时加入足够数量的酵母，满罐后进行间歇发酵，当发酵至主发酵后期，开始不断流加糖化醪，随后进行连续发酵。3.5.4浓醪发酵：常规酒精发酵：酒精度9V/V，7V/V浓醪发酵：酒精度15V/V，12V/V选育耐高糖和高酒精度的酵母菌株,研制适合浓醪发酵的发酵工艺.3.5.5固定化酵母的发酵

固定化技术

是指将游离的微生物细胞或游离的酶均匀地限制在（固定在）载体上，而经限定的微生物细胞或酶能和游离的微生物细胞或游离的酶一样具有生物学的活性和功能。

固定化技术的发展及优越性

固定化技术开始于上世纪60年代，近20年发展迅猛，其研究和应用已涉及到食品（啤酒、酒精）、医药（青霉素、头孢霉素）、化工（环氧丙烯）、氨基酸、环保（废水材料）等领域。展示着广阔的前景。优越性：可反复使用；也可存储较长的时间使酶和微生物细胞活性基本不变；易将微生物发酵改为连续发酵；发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。固定化方法包埋法：是最常用也是最为有效的固定化方法，它是直接将细胞包埋于多聚载体中制成固定化细胞，属于物理方法。包埋法常用的载体：藻酸盐、明胶、聚丙烯酰胺、琼脂等。选载体注意：无毒、耐用、低成本。包埋法所制成的固定化细胞形状可以是：小球形、小方块形、片状、棒状等。包埋法固定化技术特点：牢固，不易脱落。缺点：载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性共价键结合法细胞（酶）与不溶性的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。属于化学方法。常用载体：纤维素（多糖类衍生物）、氨基酸共聚物、苯乙烯树脂等特点：酶与载体结合比较牢固，不易脱落。但制备条件比较复杂，载体需修饰。酶功能基团：-OH，-SH，-NH3等与修饰后的载体（烷化、重氮化等）形成共价键结合。吸附法载体与细胞（酶）之间通过静电、氢键和范得华引力相互吸引得以固定。属于物理方法。常用载体：活性炭、多孔玻璃、硅胶、氧化铝等无机物。大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶等具表面活性的有机物。特点：吸附法固定细胞（酶）不牢固，易脱落。交联法利用双功能试剂或多功能试剂（交联剂）作用，使细胞（酶）与载体之间、酶与酶之间交联、凝集得以固定。常用载体：硅胶、树脂、壳聚糖等常用交联剂：戊二醛、六甲撑二胺、聚甲叉双碘乙酰胺等酶与载体结合比较牢固，不易脱落。20世纪80年代，日本协和发酵公司采用海藻酸盐为载体固定酵母细胞，发酵4-8小时，最终乙醇质量分数为6%-9%。1985年银川糖厂酒精车间进行中试，10T罐运行94天，发酵液在柱内停留12小时，最终乙醇质量分数为7.84%。工业生产中，陇西酒精厂采用固定化酵母发酵，效果为最佳。

3.5.6应用细菌的酒精发酵法

假单胞菌属的一些细菌与酵母菌酒精发酵的途径不同，即按ED途径进行酒精发酵。近年来，运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）已成为酿酒酵母之外发酵生产酒精的第二大菌种，因为与传统的酵