高三二轮复习专题二课题一微生物的实验室培养

专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养1、微生物（1）特点：形体微小，结构简单，一般肉眼看不见的低等生物的总称，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到一、基础知识（2）微生物的分类原生生物界原核生物界真菌界变形虫、草履虫、衣藻酵母菌、毛霉菌细菌放线菌蓝藻支原体衣原体病毒无细胞结构立克次氏体芽孢

有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。

因为细菌的菌落特征(形态、大小、隆起程度等）因种而异，所以菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落1.基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖、淀粉、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2、培养基凡能为微生物代谢提供碳元素的物质。①为细胞的生命活动提供能量

②为其他物质的合成提供原料⑴.概念：⑶.作用：⑵.来源：(2)碳源选修一测试一第7、9题凡能为微生物代谢提供氮元素的物质。主要用于合成蛋白质、核酸及含N的代谢产物。⑴.概念：⑵.来源：⑶.作用：(3)水：是生命活动所必需的，生物体内含量最多的化合物(4)无机盐：为微生物提供除碳、氮以外的元素无机氮源：有机氮源：NH4＋、N2、NO3-（硝化细菌、圆褐固氮菌）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、氨基酸等(2)氮源选修一测试一第9题⑶.常见的生长因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生长不可缺少的微量有机物。酶和核酸的组成成分。维生素、氨基酸、碱基等。有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压2.特殊营养（生长因子）：3.pH、氧气、渗透压的需求：注意：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁等天然营养物质中既含有碳源又同时含有氮源、生长因子等营养要素真菌的pH偏酸，细菌的pH偏碱关于微生物营养物质的叙述中，正确的是()A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量D如蛋白胨如二氧化碳如NaHCO3如NH3提供能量一般是指能参与生物体内的化学反应，一般的物质被氧化可以提供能量。NH3作为还原性物质，可以在生命过程中被氧化从而释放能量。CO2不是还原性物质，因此不可以在生命过程中被氧化释放能量。固体培养基（分离鉴定）液体培养基（工业生产）半固体培养基（观察运动）（1）按物理性质分类：根据加入琼脂的量决定天然培养基、合成培养基、半合成培养基（2）按化学成分分类：根据成分是否明确eg：牛肉膏、蛋白胨培养基（）

葡萄糖铵盐培养基（）

马铃薯蔗糖培养基（）天然合成半合成选择培养基:在培养基中加入（缺少）某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。用以菌种的分离。鉴别培养基:在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。例：大肠杆菌伊红-美蓝培养基菌落呈深紫色，并带有金属光泽（3）按功能不同分类：基础培养基:纤维素分解菌产生透明圈刚果红染色法含有微生物生长所需的基本物质。选择培养基:在培养基中加入（缺少）某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。用以菌种的分离。鉴别培养基:在培养基中加入某种指示剂或化学药品。用以菌种的鉴别。例：大肠杆菌伊红-美蓝培养基菌落呈深紫色，并带有金属光泽（3）按功能不同分类：基础培养基:纤维素分解菌产生透明圈刚果红染色法含有微生物生长所需的基本物质。培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌选择培养基B培养基+氨苄青霉素A培养基

没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出没有抗氨苄青霉素能力的细菌※几种选择培养基①加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌②不加氮源的无氮培养基分离固氮菌③不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物④加入高浓度食盐的培养基

分离金黄色葡萄球菌标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多微生物的分离、计数等半固体培养基加入琼脂较少观察微生物运动、鉴定菌种、保藏菌种等液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物选择培养基添加（或缺少）某种化学物质

培养、分离出特定的微生物无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。目的：①防止培养物被杂菌污染

②避免感染操作者

③防止污染环境防止外来杂菌的入侵关键：3、无菌技术÷①实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。②用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

（1）无菌的范围（1）消毒定义：（2）消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌的定义：是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（一般不包括芽孢和孢子）。是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽胞和孢子）。消毒和灭菌技术的原理是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分微生物一般不能灭菌强烈全部微生物能消毒与灭菌的比较无菌技术措施的选择原则①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。（3）常用的消毒方法a、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min（日常用品）b、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（不耐高温的液体）c、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源d、紫外线消毒：紫外线能破坏DNA结构，将DNA相邻的嘧啶相连形成嘧啶二聚体，适量喷洒消毒液可以加强消毒效果（无菌室）选修一测试一第8题（18年全国卷）优点：在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少a.灼烧灭菌：常用于接种环、接种针、试管口等的灭菌。（4）常用的灭菌方法酒精灯b.干热灭菌：p85160-170℃下加热1-2h。常用于一些耐高温且需要保持干燥的玻璃器皿和金属器具。c.高压蒸汽灭菌：

p85100kPa、121℃下维持15-30min.常用于培养基、无菌水等的灭菌。干热灭菌箱高压灭菌锅请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手思考酒精擦拭消毒干热灭菌高压蒸汽灭菌制备牛肉膏蛋白胨培养基1倒平板操作2接种大肠杆菌3大肠杆菌分离后保存4二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基配方牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g将上述物质溶解后，添加水，定容至1000mL配制培养基的操作步骤为:计算→称量→溶化并调pH→灭菌→倒平板→无菌检查1.计算：2.称量：依配方计算100mL培养基所需各成分的用量玻棒挑取牛肉膏于称量纸上称取。牛肉膏：0.5g蛋白胨：1.0g、NaCl：0.5g琼脂：2.0g电子天平注意：称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖防止吸收空气中水分

3.溶化并调PH：

牛肉膏、称量纸、少量水加入烧杯→加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→搅拌溶解→琼脂→搅拌熔化→补水至100mL后调pH牛肉膏黏稠，保证粘附在称量纸上的牛肉膏也溶于水中，减少误差作为凝固剂防止琼脂糊底而导致烧杯破裂使蛋白胨和氯化钠溶解先定容后调pH

培养基装入锥形瓶，加棉塞，包牛皮纸扎紧，高压蒸汽灭菌；防止污染和挥发灭菌时避免水蒸气浸湿棉塞，取出培养基时，也起到隔绝空气中杂菌的作用培养皿5～8套作一包，放于干热灭菌箱内灭菌。4.灭菌：1）2）3）4）2）右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3）用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。4）等待平板冷却凝固（约需5～10min）。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1）将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。倒平板注意事项：①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置①防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染②使培养基表面的水分更好挥发灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基6.无菌检查：37℃的恒温箱中培养12h～24h

，无杂菌污染才可用来接种.

培养基灭菌后，需冷却到什么时候，才能用来倒平板？约50℃为什么这样操作？为什么平板需倒置？5.倒平板：1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？用手触摸，刚刚不烫手时2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？灼烧灭菌，防止瓶口的微生物的污染培养基既可以使培养基表面的水分更好的挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。3.为什么将平板倒置？4.在倒平板的过程中，不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。5.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？未接种的培养基（空白培养基）在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。设计空白培养基的目的就是检查培养基是否灭菌彻底。单个细胞单个菌落微生物群分散或稀释（二）纯化大肠杆菌

原理：

方法：平板划线法和稀释涂布平板法（1）平板划线法

通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。分区划线法（每次都要灼烧）连续划线法（不用多次灼烧）聚集的菌群连续划线稀释分散单个细胞单个菌落生长繁殖取决于接种环上的菌数1.灼烧接种环，直至将接种环烧红2.在_______旁冷却接种环，并打开棉塞3.试管口通过火焰4.将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液6.将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。5.试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_______开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四区域内划线。末端8.将平板_____放入培养箱中培养。

倒置1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）微生物的恒温培养微生物的恒温培养注意：平板划线法的要点：2、接种前，每次划线前及接种后都要灼烧接种环3、接种环灼烧后等其冷却后再进行划线4、第二次及其之后的划线操作，总是从上一次划线的末端开始划线1、接种环只蘸一次菌液问题讨论①操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。②杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。③及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。四、纯化大肠杆菌1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题讨论四、纯化大肠杆菌平板划线操作区域一区域二区域三区域四区域五菌种多菌种少菌种减少菌种减少菌种减少菌种最少思考：平板划线操作的整个过程，是如何实现纯化大肠杆菌的？两区不可相连接最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。注意：若用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上。3个划线平板1个不划线平板（重复实验：避免偶然因素对实验结果的影响）（空白对照：排除非测试因素对实验结果的影响。）p22培养：倒置培养（在培养基皿底标注菌种及接种日期等信息）放入37℃恒温箱中培养12h～24h设计空白培养基的目的就是检查培养基是否灭菌彻底。①系列稀释操作：②涂布平板操作：聚集的微生物单个细胞单个菌落操作：稀释涂布平板法涂布器1、将分别盛有9ml无菌水的6支试管灭菌，并按101～106顺序编号。2、用移液管吸取1ml菌液，注入101倍稀释的试管中，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。依次类推，直至完成最后一支试管的稀释P19页。注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1∽2cm处。①系列梯度稀释操作