GB/T 42957-2023 氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定 正式版（正式版）

ICS65.120GB/T42957—2023(ISO17180:2013,Animalfeedingstuffs—Determinationoflysine,methionine国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会GB/T42957—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件修改采用ISO17180:2013《动物饲料氨基酸产品和预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨本文件与ISO17180:2013相比，在结构上有较多调整。两个文件之间的结构编号变化对照一览表见附录A。本文件与ISO17180:2013的技术差异及其原因如下：a)更改了适用范围(见第1章，ISO17180:2013的第1章),以满足我国添加剂预混合饲料产品b)更改了对试验用水的要求(见5.1,ISO17180:2013的3.1),以符合我国国家标准对试验用水e)增加了500mL的玻璃烧杯(见6.1),以增加可操作性；f)删除了500mL的容量瓶(见ISO17180:2013的4.2),以增加可操作性；g)增加了分析天平的精度要求(见6.9),以增加可操作性；h)更改了试样制备方法(见第7章，ISO17180:2013的5.1),以增加可操作性；i)增加了赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品的称样量范围(见8.2.1和8.3.1),以满足我国饲料行业赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品的实际检测需要；j)删除了实验室间检验的内容(见ISO17180:2013的7.1),以适应我国的技术条件；k)更改了精密度要求(见第10章，ISO17180:2013的7.2),以满足我国饲料行业实际检测需要；1)删除了再现性的内容(见ISO17180:2013的7.3),以适应我国的技术条件；m)删除了检测报告(见ISO17180:2013的第8章),以适应我国的技术条件。b)更改了第1章的注中简称的使用范围；c)增加了4种氨基酸标准品的CAS号；d)更改了盐酸浓度表述；f)增加了赖氨酸盐酸盐转换成赖氨酸的公式编号；g)更改了附录A的内容；请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。IⅡGB/T42957—20231GB/T42957—2023氨基酸产品和添加剂预混合饲料中本文件不适用于区分单个氨基酸的D型和L型。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理效液相色谱仪(HPLC),阳离子交换色谱柱分离，柠檬酸钠缓冲溶液进行洗脱，通过茚三酮柱后衍生紫外分光光度检测器或邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生荧光检测器对氨基酸进行测定。5试剂或材料5.2赖氨酸盐酸盐标准品(CAS号：657-27-2):纯度不低于99%,使用前放入盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。5.3苏氨酸标准品(CAS号：80-68-2):纯度不低于99%,使用前放入盛有五氧化二磷的真空干燥器中2GB/T42957—20235.4蛋氨酸标准品(CAS号：63-68-3):纯度不低于99%,使用前放入盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。5.5正亮氨酸标准品(CAS号：327-57-1):作为内标，纯度不低于99%,使用前放入盛有五氧化二磷的真空干燥器中干燥2d。5.6氢氧化钠溶液[c(NaOH)=7.5mol/L]:用于柠檬酸钠缓冲溶液pH的调节。用水(5.1)小心溶解5.8柠檬酸钠二水合物。5.9硫二甘醇。5.10苯酚：纯度不低于98.5%。(5.9)、1g(精确至0.1mg)苯酚(5.10)和16.5mL盐酸(5.7)用800mL水(5.1溶解，用少量盐酸(5.7)或氢氧化钠溶液(5.6)调节pH至2.2。苯酚起保存缓冲溶液的作用。柠檬酸钠缓冲溶液也能由柠檬酸和氯化钠制备。5.12盐酸溶液[c(HClD=0.1mol/1]量取8.2unL盐酸(5.7),加人约900mL水(5.稀释，混合均匀后加水(5.1)定容至1L。5.13正亮氨酸内标储备溶液CNie二2于mmol/L]:用01mol/I盐酸(C12)溶解0.328g(精确至0.1mg)正亮氨酸(5.5),移至1工容量瓶后定容低于℃保存，有效期B个月。5.14氨基酸标准储备溶液一25mmol1每种氨基酸分别制备标准储备溶液。标准溶液应仅包含被分析的氨基酸，即仅包含赖氨酸、苏氨酸戴蛋氨酸。市混合标准溶液，例如包含18种氨基酸的溶用0.imol/L盐酸(5.12分别溶解-0.456g(精确至0.1mg)赖安酸盐酸非标准晶(5.2)、0.297g(精5.15混合氨基酸标准工作溶液制备方法如下。a)称重稀释法：分别称量2.5mL各氨基酸标准储备溶液(5.14)的质量(mm)及2.5mL正亮氨酸内标储备溶液(5.13)的质量(mxte),然后将各氨基酸标准储备溶液(5.14)分别与正亮氨酸内标储备溶液(313)转移至50mL容量瓶(6.2)中，用柠檬酸钠缓冲溶液(5.11)定容。低于5℃保存，有效期1周b)体积稀释法：用移液管(6.4)或稀释器(6.7)移取等体积的氨基酸标准储备溶液(5.14)和正亮氨酸内标储备溶液(5.13),用柠檬酸钠缓冲溶液(5.14)稀释。5.16阳离子交换柱的洗脱缓冲液：购买市售缓冲溶液或根据仪器说明配制。通常使用3种～5种含有柠檬酸钠或碳酸钠和少量添加剂和防腐剂的缓冲溶液。5.17茚三酮或邻苯二甲醛(OPA)溶液：购买市售试剂或按照仪器说明书配制。6仪器设备36.5磁力搅拌器或摇床。6.7稀释器：选择体积稀释法时用到。如果使用茚三酮进行衍生化，将试样溶液稀释20倍后衍生；通过OPA衍生时稀释倍数更高一些。定期用天平核查体积稀释的变异系数(CV),CV不应超过1%。6.8pH计。6.10氨基酸分析仪或等效的高效液相色谱仪：b)保护柱；c)自动或手动进样系统：进样量为10μL～100μL;d)HPLC高压输液泵；e)茚三酮或OPA柱后衍生泵；f)采用茚三酮柱后衍生时用紫外检测器检测：波长440nm和570nm;OPA柱后衍生时用荧光检测器检测：激发波长330nm,发射波长460nm;g)用于峰值积分的数据采集与处理系统。7制备试样按GB/T20195制备试样。取样品至少200g,粉碎，使其全部通过0.25mm孔径的分析筛，充分混匀。8试验步骤8.1试样准备平行做两份试验。8.2称重稀释法分别称取试样(0.45g~0.47g赖氨酸盐酸盐或0.65g～0.74g赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品、0.29g~0.31g苏氨酸、0.36g～0.38g蛋氨酸)(精确至0.1mg)于500mL玻璃烧杯中(6.1),加入约400mL0.1mol/L盐酸溶液(5.12)。用磁力搅拌器(6.5)搅拌30min溶解试样，称量提取液的总质量(mex)(精确至1mg)。用刻度移液管(6.4)移取并称量1mL提取液(ma)置于50mL容量瓶(6.2)中(精确至0.1mg),随后移取并称量2.5mL正亮氨酸内标储备溶液(5.13)(mNg)加入该容量瓶(6.2)(精确至0.1mg),最后用柠檬酸钠缓冲溶液(5.11)定容并混合均匀。如果试样不在当天上机检测，则应在5℃以下存放不超过1周。8.2.2添加剂预混合饲料或混合型饲料添加剂氨基酸产品通过预测试样中氨基酸含量的最低值，按公式(1)计算出大致的试样称样量mppremix,单位为克4GB/T42957—2023以蛋氨酸为例，用于饲料添加剂蛋氨酸检测的称样量为0.36g～0.38g,因此，对于含有20%质量根据试样称样量的计算结果称取样品，并将称量好的试样置于500mL玻璃烧杯(6.1)中(精确至提取液的总质量(mex)(精确至1mg)。移取并称量1mL(精确至0.1mg)提取液(m)于50mL容量如果试样中氨基酸含量较高，可采用不超过1mL的提取物溶液加2.5mL正亮氨酸内标储备溶液如果试样不在当天上机检测，则应在5℃以下存放不超过3d。8.3体积稀释法分别称取试样(0.45g0.47顺氨酸盐酸盐或-065g0.74g赖氨酸硫酸盐及其发酵副产品、0.29g~0.31g苏氨酸、0.36-g0.38g蛋氨酸精确至0.1n)1-000玻璃烧杯中(6.1),加入900mL0.1mol/L盐酸溶液(5.-12)磁力搅器(6.5)搅30min用工工的容量瓶(6.2)是容并混合均匀。按照5.15b)标准溶液的配制过程进行试样稀释并加入正亮氨酸内标储备溶液(5.13)如果试样不在当天上机检测则应在5C以下存放不超过3d根据8.2.2描述的通过顶测试样中氨基酸含量的最低值Go)计算试样的近似称样量mppremk,以克(g)为单位，确保试样提取液中所测氨基酸的峰面积都在标准曲线的线性范围内。胺照计算结果称取样品于1000mL玻璃烧杯(6.1)中(精确至0.1mg),加入900mL0.1mol/盐酸溶液(5.12),磁力搅拌器(6.5)搅拌30mn,用1L的容量瓶(6.2)定容并混合均匀。按照5.15b)标准溶液的配制过程进行试样稀释并加入正亮氨酸内标储备溶液(5.13)。如果预混料中含有其他氨基酸浓度较高，则可采用不超过1ml.的提取物加2.5mL正亮氨酸内标储备溶液(5.13)的方法稀释如果试样不能在当天上机检测，则应在5℃下保存不超过3d。(6.10)中。进样量一般为20μL～50μL。为了避免因峰重叠而产生的错误结果，所分析的氨基酸色谱峰基线应与其他被洗脱的杂质色谱峰基线实现100%分离。色谱峰面积应与标准曲线的浓度呈现良好的线性关系。59试验数据处理9.1方法校准控制用标准溶液(5.15)计算试样中每种氨基酸的含量。为监测测定结果是否漂移，每进4针后插入标准溶液作为质量控制。如果这些质控试样的回收率在99%～101%之外，重复分析试样。通过积分确定标准溶液和试样中待测氨基酸峰的峰面积，并按9.2或9.3计算试样中氨基酸的质量分数。9.2称重稀释法数据处理Aaac一标准容液中待测氨基酸的峰面积Frm—待测氨基酸的响应因子Y.—为1000g;按公式(4)计算氨基酸的响应因子(FRa):……(4)ANee——标准溶液中正亮氨酸的峰面积；Aa——标准溶液中待测氨基酸的峰面积。试样中氨基酸的含量以其质量分数wm(%)计，按公式(5)计算： (5)6GB/T42957—2023式中：Aats——试样溶液中待测氨基酸的峰面积；FR——待测氨基酸的响应因子；Ya——氨基酸在储备溶液中的质量浓度，单位为克每升(g/L);ANst试样溶液中正亮氨酸的峰面积；注：计算结果以“原样”表示。根据含量计算规则，如氨基酸含量以干物质计，则检测样品的干物质；如果产品直接分析，计算结果即以原样计。赖氨酸盐酸盐的结果能通过公式(6)转换成赖氨酸： (6)式中：10精密度两份平行试样分析结果。按公式(7)计算相对差值，结果以%表示： (7)式中：|wm-wm₂|两次检测结果之间的绝对差值。对于氨基酸含量大于或等于10%