2025届高考生物一轮总复习学生用书选择性必修3第十单元生物技术与工程第51讲基因工程的基本工具和基本操作程序考点二基因工程的基本操作程序

考点二基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获得（1）目的基因的获得方法：人工合成目的基因、利用目的基因、通过构建基因文库来获得目的基因。（2）利用PCR获得和扩增目的基因。[易错提示]变性过程双链DNA解聚为单链不须要解旋酶。在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成供应能量；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端起先连接脱氧核苷酸；真核细胞和细菌的DNA聚合酶都须要Mg2＋激活，故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。2.基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）（2）组成。[易错提示]启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区分项目位置作用启动子位于DNA分子上RNA聚合酶识别和结合部位，启动转录过程起始密码子位于mRNA分子上确定翻译的起先终止子位于DNA分子上确定转录的结束终止密码子位于mRNA分子上确定翻译的结束（3）[易错提示]若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种状况：目的基因与目的基因连接；目的基因与质粒连接；质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。3.将目的基因导入受体细胞（1）植物细胞。[易错提示]农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是指将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上，其次次拼接（非人工操作）是指将插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是指将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌，其次次导入（非人工操作）是指将含目的基因的T­DNA导入受体细胞。导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。（2）动物细胞：法，将目的基因注入动物的中。（3）原核生物：先用处理大肠杆菌细胞，使之处于一种能吸取四周环境中的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。4.目的基因的检测与鉴定[易错提示]分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时，都遵循碱基互补配对原则；都运用基因探针，探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。[答案自填]1.（1）PCR获得和扩增（2）DNA半保留复制引物脱氧核苷酸耐高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶指数形式琼脂糖凝胶电泳2.（1）在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代（2）RNA聚合酶转录（3）目的基因相同3.（1）花粉管通道Ti质粒T­DNA染色体DNA（2）显微注射受精卵（3）Ca2＋DNA分子4.染色体DNA目的基因mRNA抗原—抗体转基因[教材命题点思索]1.目前在PCR反应中运用TaqDNA聚合酶而不运用大肠杆菌DNA聚合酶的主要缘由是什么？提示：在PCR过程中，要加热超过90℃，所以运用TaqDNA聚合酶，而不运用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。2.以mRNA为材料可以获得DNA，其原理是_________________________________________________。提示：在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板依据碱基互补配对的原则可以合成DNA3.从受体细胞中分别纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是_____________________________________。提示：抗体抗原、抗体特异性结合4.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用检测目的基因是否已插入，又要在个体水平上鉴定，后者的具体过程是_________________________________________________________________。提示：PCR技术将培育的烟草幼苗栽培于含有确定盐的土壤中，视察该烟草植株的生长状态[模型命题点思索]5.据图回答下列问题。（1）从图中可以看出，目的基因是________________________________________________________________________，运用的载体是，将目的基因导入受体细胞的方法是。（2）若进行个体生物学水平的鉴定，则接受的方法是______________________________________________________。提示：（1）Bt抗虫蛋白基因Ti质粒农杆菌转化法（2）用棉叶饲喂棉铃虫1.PCR循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A（或B）的DNA分子数1372n－1同时含引物A、B的DNA分子数0262n－2共消耗的引物数量26142n＋1－2注：第三轮循环后，起先出现双链等长的目的基因片段。2.筛选出含有目的基因的受体细胞（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，假如插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。（2）被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。（3）筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培育基上培育，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如下图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培育基上，如下图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培育基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如下图1、5菌落。最终，可在含氨苄青霉素的培育基上挑取1、5菌落进行培育。考向1PCR及应用1.（2024·梅州联考）PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（）A．图示环节所需的温度比上一个环节的低B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端C．TaqDNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成D．经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同解析：选D。题图中环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度（50℃左右）比变性的温度（90℃以上）低，A项正确；在PCR扩增中，子链延长的方向是从5′端到3′端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端，B项正确；TaqDNA聚合酶能催化磷酸二酯键的形成，C项正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不愿定相同，一般PCR第三轮才可以扩增出双链脱氧核苷酸数量相同的子代DNA，D项错误。2.重叠延长PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分相互搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延长PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是（）A．引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过2次复制解析：选C。C与G之间有3个氢键，A与T之间有2个氢键，因此引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高，A项正确；由题图可知，引物2和引物3分别作用于同一段DNA的两条链，二者会发生碱基互补配对，因此需将它们置于不同反应系统中，B项正确；引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，各产生2种双链DNA分子，由于引物1和引物4合成的DNA属于同一种DNA，因此共产生了3种双链DNA分子，C项错误；在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成题图所示双链DNA，至少要经过2次复制，D项正确。考向2基因工程的操作程序3.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示。请回答下列问题：（1）将目的基因导入植物细胞，接受最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为。该方法中农杆菌的作用是____________________________________________。（2）在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是___________________________________。（3）含有目的基因的农杆菌可依据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素培育基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已有目的基因？（填“是”或“否”）。为什么？____________________________________。（4）将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培育基中培育，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B（含氨苄青霉素）和C（含四环素和氨苄青霉素）两个培育基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如下图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。答案：（1）Ti质粒T­DNA感染烟草细胞，把目的基因插入烟草细胞的染色体DNA上（2）防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率，防止目的基因与质粒反向连接（3）否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏（4）4.（2024·广东选择考）种子大小是作物重要的产量性状。探讨者对野生型拟南芥（2n＝10）进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发觉野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推想突变体的表型与其有关，开展相关试验。回答下列问题：（1）拟接受农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与植株的种子大小相近。（2）用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________________________________________。（3）转化后，T－DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分别及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如下图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培育基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________________________________________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培育基，选择阳性率约%的培育基中幼苗接着培育。③将②中选出的T2代阳性植株（填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培育基，阳性率达到%的培育基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续探讨中检测该突变，探讨者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再运用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。解析：（1）据题干信息可知，突变体是由野生型DA1基因发生隐性突变形成的，接受农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。（2）构建基因表达载体时，须要用限制性内切核酸酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为载体的Ti质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达，DA1基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。（3）①卡那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在含有卡那霉素的培育基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DA1基因（和卡那霉素抗性基因）。②假设DA1基因用A表示，结合题中信息可知，T1代中能在含有卡那霉素的培