《微生物基》课件-单元八 微生物的常规检验技术

微生物学基础单元十一微生物的常规检验技术

１细菌总数测定的概念和意义一、细菌总数的测定

项目一微生物的常规检验技术细菌总数测定的概念：指单位质量或体积的被检食品（药物)中所含活的细菌总数；检测细菌总数的卫生学意义:

✔细菌总数可以作为食品（药物)被污染程度的标志。细菌总数越多，则表明食品（药物）污染越严重,受致病菌污染的可能性也越大；

✔细菌总数可以预测食品存放的期限。如细菌总数为10个/cm2的鱼在0℃下只可保存6天,而总数为103个/cm2的鱼可保存12天。

2细菌总数测定的目的要求和基本原理一、细菌总数的测定

目的要求：

✔学习活菌计数的技术方法；

✔掌握细菌总数的测定及报告方式；基本原理:

✔细菌总数是指食品（药物)检样经过处理,在一定条件（培养基、培养温度和培养时间等)下培养后,所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数；

✔平板计数法是通过将样品稀释成系列稀释液,使样品中细菌分散成单个细胞,取一定量的稀释液接种，使其均匀分布在计数平板上。一般认为每个菌落由一个细菌繁殖而成,因此,培养后统计菌落数目即可计算出样品中的细菌数；

✔用这种方法测得的菌落数是培养基上生长的活菌数,不含有死菌,故此法又称为活菌计数法。

３实训用品一、细菌总数的测定

实训用品：培养基和试剂：平板计数琼脂培养基,磷酸盐缓冲液,无菌生理盐水；仪器和材料：恒温培养箱（36℃±1℃,30℃±1℃)、冰箱（2~5℃)、恒温水浴箱(46℃土1℃)、天平（感量为0.1g)、均质器、振荡器、吸管(1mL和10mL)、锥形瓶(容量250mL、500mL)、培养皿(直径90mm)。

４操作步骤一、细菌总数的测定

细菌总数检验程序：

４操作步骤－－样品稀释一、细菌总数的测定

样品稀释步骤：第一步：固体和半固体样品称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000~10000r/min均质1~2min，制成1:10的样品匀液；第二步：液体样品以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀,制成1:10的样品匀液；第三步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液；第四步：按上项操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1支1mL的无菌吸管；

４操作步骤－－样品稀释一、细菌总数的测定

样品稀释步骤：第五步：根据对样品污染状况的估计,选择2~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照；第六步：及时将冷至46℃的平板计数琼脂培养基（于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿15~20mL，并转动平皿使其混合均匀；

４操作步骤－－培养一、细菌总数的测定

培养操作步骤：第一步：待琼脂凝固后,将平板翻转,置36℃±1℃温箱内培养48h±2h；第二步：如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL),凝固后翻转平板，进行培养。

４操作步骤－－菌落计数一、细菌总数的测定

菌落计数操作步骤：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,cfu)表示；第一步：选取菌落数在30~300cfu、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30cfu的平板记录具体菌落数,大于300cfu的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数；第二步：其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数；第三步：当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

４操作步骤－－结果与报告一、细菌总数的测定

结果与报告：菌落总数的６种计算方法①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值,平均值乘以相应稀释倍数,即为每g（mL)样品中细菌总数；

②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内,按如下公式计算:

４操作步骤－－结果与报告一、细菌总数的测定

结果与报告：菌落总数的６种计算方法③若所有稀释度的平板上菌落数均大于300cfu，则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；

④若所有稀释度的平板菌落数均小于30cfu，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；

⑤若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；

⑥若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300cfu，其中一部分小于30cfu或大于300cfu时，则以最接近30cfu或300cfu的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

４操作步骤－－结果与报告一、细菌总数的测定

结果与报告：菌落总数报告的５个原则

①菌落数小于100cfu时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告；②菌落数大于或等于100cfu时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字,后面用０代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字；

③若所有平板上为蔓延菌落而无法计数则报告菌落蔓延；

④若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效；

⑤称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告。

５实训结果一、细菌总数的测定

实训结果：将各稀释度的平板菌落数填入下表：结果报告：该样品的细菌总数是________cfu/g(mL)。培养皿序号稀释度培养皿１培养皿２平均数

６注意事项一、细菌总数的测定

注意事项：检验中所用玻璃器皿,如培养皿、吸管、试管等必须彻底洗涤干净方可进行灭菌,不得残留有抑菌物质；用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。若空白对照上有菌落生长,则检测结果无效,同时要查明污染的来源；检样加入培养皿后，应在20min内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混合均匀，防止细菌增殖及产生片状菌落。检样与琼脂混合时，可将皿底在平面上先前后左右摇动，然后按顺时针方向和逆时针方向旋转,以充分混匀。混合过程中不得使混合物溅到皿边的上方；如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，则可能是检验工作中发生差错，或者是样品中混入抑菌剂，不可作检样计数报告的依据。

１大肠菌群测定的概念和意义二、大肠菌群的测定

项目一微生物的常规检验技术大肠菌群测定的概念：大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌,包括肠杆菌科中埃希菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属等,其中以埃希菌属为主；大肠菌群测定的卫生学意义:

✔大肠菌群直接或间接来源于人畜粪便，可以作为粪便污染食品的指标菌。若食品中检测出大肠菌群，则表明食品曾受到过人或温血动物粪便的污染；

✔可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌。肠道致病菌如沙门菌属和志贺菌属等，对食品的安全性威胁很大，逐批或经常检验致病菌有一定的困难，而大肠菌群较易检验，且肠道致病菌与大肠菌群的来源相同，在体外生存时间也一致，因此大肠菌群也可作为肠道致病菌污染食品的指示菌。

2大肠菌群测定的目的要求和基本原理二、大肠菌群的测定

目的要求：

✔学习并掌握食品大肠菌群的测定方法；

✔掌握大肠菌群检测结果的报告方式；基本原理:

✔大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标评价食品的卫生质量,推断食品中是否污染致病菌；

✔大肠菌群是指一群能发酵乳糖，产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。在结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)平板上,大肠菌群的典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大；

✔食品中大肠菌群数以g(mL)检样内大肠菌群最可能数（MPN)表示，或者以每g（mL)检样内大肠菌群菌落数（cfu）表示。

３实训用品二、大肠菌群的测定

实训用品：培养基和试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST)肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/LNaOH、无菌1mol/LHCl；仪器和材料：恒温培养箱（36℃±1℃,30℃±1℃)、冰箱（2~5℃)、恒温水浴箱(46℃±1℃)、天平（感量为0.1g)、均质器、吸管（1mL和10mL)、锥形瓶（容量500mL)、培养皿（直径90mm)、pH计或精密pH试纸。

４操作步骤－方法一：大肠菌群MPN计数法二、大肠菌群的测定

方法一大肠菌群MPN计数法：检验程序如下

４操作步骤－方法一：大肠菌群MPN计数法二、大肠菌群的测定

样品稀释步骤：第一步：固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000~10000r/min均质1~2min，制成1:10的样品匀液；第二步：液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀,制成1:10的样品匀液；第三步：样品匀液的pH应为6.5~7.5，必要时分别用1moL/LNaOH或1mol/LHCI调节。第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液；第五步：按上项操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1支1mL的无菌吸管；从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

４操作步骤－方法一：大肠菌群MPN计数法二、大肠菌群的测定

初发酵试验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液)，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST)肉汤，每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)，36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性；复发酵试验：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物１环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠菌群最可能数(MPN）的报告：按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL)样品中大肠菌群的MPN值。

４操作步骤－方法一：大肠菌群MPN计数法二、大肠菌群的测定

大肠菌群最可能数(MPN）检索表：

４操作步骤－方法二：大肠菌群平板计数法二、大肠菌群的测定

大肠菌群平板计数法检验程序：

４操作步骤－方法二：大肠菌群平板计数法二、大肠菌群的测定

样品的稀释：按方法一进行操作；平板计数：第一步：选取2~3个适宜的连续稀释度，每个稀释度度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL生理盐水加人无菌平皿作空白对照；第二步：及时将15~20mL冷至46℃结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3~4mIVRBA覆盖平板表层，翻转平板，于36℃±1℃培养18~24h；第三步：平板菌落数的选择：选取菌落数在15~150cfu的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

４操作步骤－方法二：大肠菌群平板计数法二、大肠菌群的测定

平板计数：第四步证实试验：从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性；第五步

大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以第三步中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例如:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×104=6.0×105cfu/g(mL)。

５实验结果１（大肠菌群MPN计数法）二、大肠菌群的测定

将大肠菌群MPN计数法各步实验结果填入下表中：管号稀释度初发酵试验复发酵试验大肠菌群阳性/阴性根据结果查大肠菌群MPN检索表，得出每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

５实验结果２（大肠菌群平板计数法）二、大肠菌群的测定

将大肠菌群平板计数法各步实验结果填入下表中：根据典型和可疑菌落数及BGLB肉汤管阳性管数，得出每g(mL)样品中大肠菌群是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。平板计数培养皿序号稀释度培养皿１培养皿２平均数典型和可疑菌落数证实实验BGLB肉汤管阳性管数

６注意事项二、大肠菌群的测定

这两种方法都需两步即可判定。第一步不是纯菌培养，而是样品初培养结果，有时阳性结果经过第二步BGLB发酵试验后可能成为阴性。因此应结合两步的结果方可做出判断；胆盐和月桂基硫酸钠是抑菌剂，可抑制某些杂菌,有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生抑制作用；在VRBA琼脂平板上,大肠菌群的典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大；MPN检索表中的MPN是表示样品中活菌密度的估测，该表采用3种稀释度9管法，稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测,若无法估测，则应做一定范围的稀释度；在查阅MPN检索表时，应注意:

✔该表采用3个稀释度〔0.1g（mL)、0.01g（mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管；

✔表内所列检样量如改用1g（mL)、0.1g（mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g（mL)、0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍，其余类推。

１霉菌、酵母菌菌数测定的概念和意义三、霉菌、酵母菌菌数的测定

项目一微生物的常规检验技术霉菌、酵母菌菌数测定的概念：霉菌和酵母菌分布广泛,在食品和药物上可作为正常菌群的一部分,或随空气传播，在消毒不适当的设备上发现，故可测定出霉菌、酵母菌的菌数；霉菌、酵母菌菌数测定的卫生学意义:食品和药物若遭受霉菌和酵母菌的侵染,则发生霉坏变质，而引起急性和慢性中毒；因此,对食品和药物中的霉菌和酵母菌进行检测,具有重要的卫生学意义。

２霉菌、酵母菌菌数测定的目的要求和基本原理三、霉菌、酵母菌菌数的测定

目的要求：掌握霉菌和酵母菌总数的测定方法；基本原理:霉菌和酵母菌菌数是指食品（药物）检样经过处理,在一定条件下培养后，所得

1g或1mL检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。霉菌和酵母菌菌数主要作为食品、药物被真菌污染的标志，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

３实训用品三、霉菌、酵母菌菌数的测定

培养基和试剂：马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基、盂加拉红培养基；仪器和材料:恒温培养箱(28℃±1℃)、冰箱(2℃~5℃)、恒温水浴箱(46℃±1℃)、天平(感量

为0.1g)、均质器、振荡器、显微镜(10×~100×)；

吸管(1mL和10ml)、锥形瓶(容量250mL、500ml)、广口瓶(500mL)、培养皿(直径

90mm)、试管(10mm×75mm)、牛皮纸袋、塑料袋。

4检验程序三、霉菌、酵母菌菌数的测定

5操作步骤--样品的稀释三、霉菌、酵母菌菌数的测定

样品稀释步骤：第一步：固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，制成1:10的样品匀液；第二步：液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀,制成1:10的样品匀液；第三步：取1mL1:10稀释液注入含有9ml无菌水的试管中，另换一支1mL无菌吸管反复吹吸，此液为1:100稀释液；第四步：按上项操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管；第五步：根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1ml样品稀释液加人2个无菌平皿作空白对照；第六步：及时将15-20mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混匀。

5操作步骤--培养、菌落计数三、霉菌、酵母菌菌数的测定

培养：待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养５d,观察并记录；菌落计数：

✔肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数，以菌落形成单位(cfu)表示；

✔选取菌落数在10~150cfu的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数；霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。

６结果与报告三、霉菌、酵母菌菌数的测定

结果计算方法：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算；

✔若所有平板上菌落数均大于150cfu,，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；

✔若所有平板上菌落数均小于10cfu,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；

✔若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数；结果报告方法：

✔菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告；

✔菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字；

✔称重取样以cfu/g为单位报告，体积取样以cfu/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。

７实训结果三、霉菌、酵母菌菌数的测定

将各稀释度的霉菌和酵母菌菌落数填入下表：培养皿号稀释度培养皿１培养皿２平均数该样品的霉菌和酵母菌总数是：___________cfu/g（mL）。

８霉菌直接镜检计数法（郝氏霉菌计测法)cfu/g(mL)三、霉菌、酵母菌菌数的测定

仪器与材料：折光仪、显微镜、郝氏计测玻片(具有标准计测室的特制玻片)、盖玻片、测微器(具标准刻度的玻片)；操作步骤：第一步：检样的制备：取定量检样。加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447~1.3460(即浓度为7.9%~8.89%),备用；第二步：显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90~125倍调节标准视野,使其直径为1.382mm；第三步：涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀地摊布于计测室,以备观察；第四步：观测：将制好的载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样观察50个视野,同一检样应由两人进行观察；第五步：结果与计算：在标准视野下,发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的I/6（即测微器的一格)时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。

９注意事项三、霉菌、酵母菌菌数的测定

目前国外测定霉菌和酵母菌数常用的培养基有酸性马铃薯葡葡糖琼脂、平板计数琼脂、嗜真菌性琼脂和麦芽汁琼脂等，测定霉菌和酵母菌数的效果一致。在嗜真菌性琼脂上，霉菌生长迅速易使菌落连在一起，因此采用此培养基计数时，必须在2d之内开始计数；本方法两种计数培养基加入的抗生素，可以抑制细菌的生长，有利于霉菌和酵母菌的计数,但对某此霉菌的分离鉴定有一定的影响;孟加拉红可以抑制霉菌的蔓延生长，对细菌和放线菌也有一定的抑制作用；大多数霉菌和酵母菌在25~30℃的条件下生长良好，国家标准推荐的培养温度为28℃±1℃,此时霉菌和酵母菌的生长速度最快；霉菌直接镜检计数法中,常用方法为郝氏霉菌计测法，该方法适用于番茄酱罐头。

１乳酸菌检验的意义四、乳酸菌的检验

项目一微生物的常规检验技术乳酸菌检验的意义：乳酸菌不是分类学名词，是指能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的细菌的统称。乳酸菌因具有重要的生理功能、有助于人体健康而应用广泛。因而有些国家将活性发酵乳制品中乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和检测质量的依据。乳杆菌双歧杆菌链球菌

２乳酸菌检验的目的要求、基本原理四、乳酸菌的检验

目的要求：

✔学习并掌握乳酸菌的检验技术；

✔了解乳酸菌的鉴定方法；基本原理：

✔乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸,需氧和兼性厌氧,多数无动力,过氧化氢酶阴性,革兰阳性的无芽孢杆菌和球菌。此方法中乳酸菌主要为乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属。

✔乳酸菌菌落数指检样在一定条件下培养后,所得1g或1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数；

３实训用品四、乳酸菌的检验

培养基和试剂：MRS培养基、莫匹罗星锂盐改良MRS培养基、MC培养基（ModifiedChalmers培养基)、革兰染色液、莫匹罗星锂盐（化学纯)；

仪器和材料：恒温培养箱（36℃±1℃)、冰箱（2~5℃)、恒温水浴箱(46℃±1℃)、天平(感量为0.1g)、均质器、振荡器、吸管（1mL和10mL)、锥形瓶(容量250mL、500mL)、培养皿(直径90mm)、试管（18mm×180mm、15mm×100mm)。

４检验程序四、乳酸菌的检验

５操作步骤--样品制备四、乳酸菌的检验

样品制备无菌操作程序：第一步：冷冻样品

可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min；第二步：固体和半固体食品

以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，8000~10000r/min均质1~2min，制成1:10样品匀液；第三步：液体样品

应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样品匀液；第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液；第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管。