GB∕T 39920-2021 蛙病毒感染检疫技术规范(正式版)

GB/T39920—2021蛙病毒感染检疫技术规范国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会—GB/T39920—2021—本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。1GB/T39920—2021蛙病毒感染检疫技术规范本标准给出了两栖类动物蛙病毒感染(infectionwithRanavirus)的临床症状，规定了蛙病毒感染2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay)EPC:鲤上皮瘤细胞系(epitheliomapapulosumcyprinicellline)HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid]IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinG)MCP:主衣壳蛋白(majorcapsidprotein)OD:光密度(opticaldensity)PBST:含有Tween-20的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsalineTween-20)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)Taq:水生栖热菌(thermusaquaticus)24试剂或材料4.9MgCl₂:25mmol/L,—20℃保存。a)正向引物F:5'CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT3';b)反向引物R:5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3';3用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1:10的比例将其重悬于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液(见附录B中B.1)中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。用细胞培养液对1:10的组织匀浆上清液再做2次10倍稀释，然后将1:10、1:100和1:1000三个稀释度的上清液接种到生长约24h的EPC单层细胞上(96孔板中),每个样品至少接种3孔，每孔接种100μL,置于25℃培养。试验设置3孔阳性对照(接种病毒参考株)和3孔空白对照(未8.1.2.3如果空白对照细胞形态正常，阳性对照孔细胞出现CPE,当接种被检匀浆上清稀释液的细胞8.2PCR检测8.2.2DNA抽提离心5min,取上层水相(约600μL),4GB/T39920—20218.2.3PCR扩增在PCR管中加入以下试剂：10×PCR缓冲液(不含Mg²+)10μL、25mmol/L的MgCl₂10μL、用1×电泳缓冲液(见B.7)配制1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5pg/mLEB,见B.8,或其他经过验证的等效染色试剂)。将5μL样品和1pL6×上样缓冲液(见B.9)混匀后加入样品孔进行电泳。电泳结束8.2.5设立对照8.2.5.2取含有已知蛙病毒参考株的细胞悬液或已知感染蛙病毒的组织作为阳性对照。8.2.5.3取正常的细胞悬液或阴性组织作为阴性对照。8.2.5.4取等体积的水代替模板作为空白对照。8.2.6.1PCR产物电泳后，阳性对照会出现585bp的DNA片段，阴性对照和空白对照均没有该核酸带。8.2.6.2待测样品PCR扩增后，在585bp的位置上有条带者，切胶后进行测序。8.2.6.3将测序获得序列(参见附录C)与已知的蛙病毒MCP基因序列进行比对，如果与其同源性最近8.3ELISA检测8.3.1.1用pH9.6的包被液(见B.10)按说明书稀释纯化的蛙病毒单克隆抗体，包被ELISA板，每孔8.3.1.2用含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(PBST,见B.12)洗3次。8.3.1.4加入2倍或4倍系列稀释的待测样品或者病毒培养液、蛙病毒参考株(阳性对照)、正常组织样品(阴性对照)和细胞培养液(空白对照),各加2孔，每孔100μL,37℃孵育1h。PBST洗3次。8.3.1.5将山羊抗蛙病毒血清用细胞培养液稀释到工作浓度，每孔加100μL,37℃孵育1h。PBST洗3次。8.3.1.6加入0.1%H₂O₂(用双蒸水稀释),每孔150μL,37℃孵育15min,PBST洗2次。8.3.1.7将辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(酶标二抗)用细胞培养液稀释到工作浓度，每孔100μL,8.3.1.8加入底物(见B.15),每孔100μL,37℃,避光反应10min～30min,当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加入终止液每孔150pL,用酶标仪测量各孔在450nm波长时的光密度值(OD₄₅05GB/T39920—2021以空白对照的OD₄so值为零点，先计算阳性对照和阴性对照的OD₄50值之比。如果阳性对照孔的OD₄₅0值(P)与阴性对照孔的OD₄₅0值(N)之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1),表明对照成立。再计算待测样品孔与阴性对照孔的OD₄so值之比。当样品孔的OD5o值(P)与阴性对照孔ODso值(N)之比大9综合判定6(资料性附录)蛙病毒感染概述A.1病原“蛙病毒感染”中的蛙病毒是指虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)中感染两栖类动物的成员。蛙病毒是大型的双链DNA病毒，病毒粒子直径为150nm～170nm,二十面体对称，基因组大小为105kb～140kb。A.2症状与流行两栖类动物感染蛙病毒后的症状表现为：慢性溃疡综合征和急性出血综合征。患病幼体的足底表面皮下组织、腹股沟处以及腹部出现小面积的多灶性出血，伴有腹部水肿，在皮肤上可能形成苍白病灶。平衡失调。两栖类所有成员均易感，自然条件下蛙病毒主要感染有尾目和无尾目的大多数成员。蛙病毒感染可通过动物间相互接触、食入感染、濒死和死亡个体而传播，也可通过水源及其他途径进行传播，包括活鱼运输或鱼饵等，流行范围广泛。20世纪60年代，首次在牛蛙(Ranacatesbeima)蝌蚪期分离到蛙病毒，随后大量蛙病毒从暴发性疾病中被分离出。据报道，自1991年开始，已有约80种蛙病毒感染两栖类和爬行类动物并致病，蛙病毒感染是导致两栖类动物大量死亡的重要原因。A.3诊断两栖类动物突发大量死亡，并伴有皮肤溃疡和/或远端肢体坏死等慢性病症状，初步提示有蛙病毒感染。用病毒分离、PCR或ELISA方法检测确诊。7(规范性附录)B.1细胞培养液使用M199培养基(含Earle's盐),按说明书的要求，用一级水配制，然后加入10%经56℃30min灭活的胎牛血清，用NaHCO₃粉末调节培养液的pH为7.2～7.4。过滤除菌，分装后-20℃保存。在开放系统使用时，如96孔细胞培养板，需要加入过滤除菌的HEPES,使其在培养液中的终浓度为B.2细胞消化液(EDTA0.02%、胰酶0.06%的PBS缓冲液)NaClKH₂PO₄Na₂HPO4·12H₂OEDTA胰酶0.22.30.2加入NaHCO₃(大约0.4g～0.6ggggggg),调节pH至7.4～8.0(pH<7.4时EDTA难溶),充分搅拌直至无不溶物为止。过滤除菌，分装后—20℃保存。NaCl8.19gEDTA0.744g容至100mL。使用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%。B.4抽提液Ilmol/LTris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1混合，密闭避光保存。B.5抽提液Ⅱ将氯仿和异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。B.650×电泳缓冲液8GB/T39920—2021Na₂EDTA·2H₂O37.2g冰乙酸加水定容至室温贮存。50×电泳缓冲液加水定容至室温贮存。B.8溴化乙锭(EB)用水配制成10mg/mLB.96×上样缓冲液溴酚蓝B.10包被液(pH9.6)Na₂CO₃NaHCO₃水2.93gNaClNa₂HPO₄·12H₂OKH₂PO₄KCl水B.12洗涤液PBST0.01molTween-209B.13TMB储存液DMF(N,N-Dimethylformamide5mL/瓶)B.14底物缓冲液(pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液)柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)Na₂HPO₄·12H₂O蒸馏水B.15底物(用时新鲜配制)底物缓冲液TMB储存液GB/T39920—2021250mgGB/T39920—2021(资料性附录)lCGCAGTCAAGGCCTTGATGTTTATGGTGCAGAACGTCACACACCCTTCCGTCGGCTCCAA61TTACACCTGCGTCACTCCCGTCGTGGGAGTCGGCAACACGGTCCTGGAGCCAGCCCTTGC121GGTAGATCCCGTCAAGAGCGCCAGCCTGGTGTACGAAAACACCACAAGGCTCCCCGACAT181GGGAGTCGAGTACTACTCGCTGGTGGAGCCCTGGTACTATGCCACCTCCATCCCAGTCAG241CACCGGGCACCACCTCTACTCTTATGCCCTCAGCCTGCAGGACCCCCACCCATCCGGATC301CACCAATTACGGTAGACTGACCAACGCCAGCCTTAACGTCACCCTGTCCGCTGAGGCCA