朱玉贤《现代分子生物学》考研考点讲义

目录第一章绪论 (1)第二章染色体与DNA (6)第三章生物信息的传递(上)—从DNA到RNA (43)第四章生物信息的传递(下)—从mRNA到蛋白质 (60)第五章基因的表达与调控(上)—原核基因表达调控模式 (76)第六章基因的表达与调控(下)—真核基因表达调控 (99)第七章分子生物学基本研究法(上)—DNA、RNA及蛋白质操作技术 (123)第八章分子生物学研究法(下)—基因功能研究技术 (138)第九章疾病与人类健康 (153)第十章基因与发育 (171)第十一章基因组与比较基因组学 (191)第一章绪论【考情分析】1．重要程度：...2．常考题型：名词解释、判断、填空、简答、论述本章重点：分子生物学概念的理解和分子生物学重大发现的意义。本章难点：分子生物学概念的的准确理解、未来分子生物学的发展趋向。【主要内容】第一节分子生物学发展的基础第二节分子生物学发展简史第三节分子生物学研究的主要内容第一节分子生物学发展的基础【考试要点】分子生物学建立时期重要事件及其学说：·创世说·进化论·细胞学说·生物化学·遗传学3个与一切生物学现象有关的问题：口生命是怎样起源的？口为什么“有其父必有其子”？口动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的？直到19世纪初，只能用迷信或宗教回答。19世纪末，达尔文生物进化学说，成为生物学发展史上的伟大创举之一。—2—他们认为：所有组织的最基本单元是形状非常相似而又高度分化的细胞。细胞的发生和形成是生物界普遍和永久的规律。三、经典的生物化学和遗传学进化论和细胞学说的结合，产生了现代生物学。而以研究动、植物遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。 (一)经典的生物化学的成就十九世纪，人们就已经发现了蛋白质。到二十世纪初，组成蛋白质的20种氨基酸被相继发现。Fisher还论证了连接相邻氨基酸的“肽键”的形成。细胞的其他成分，如脂类、糖类和核酸也相继被认识和部分纯化。 (二)经典遗传学的建立和发展条基本规律：统一律和分离律。他认为：生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些因子可以从子代，代代相传。二十世纪初，美国遗传学家Morgan提出了基因学说。他指出：种质必须由独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子，或者简单地称为基因。Morgan及其助手发现了连锁遗传规律，并且第一次将代表某一性状的基因，同某一特定的染色体联系起来。史【考试要点】重要概念证明遗传物质的几个实验DNA结构及复制方式遗传信息传递的中心法则分子生物学：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。口研究对象：一切生命形式1928年英国科学家Griffith等人发现肺炎链球菌可以引起肺炎，导致小鼠死亡。—3—1944年美国微生物学家Avery通过肺炎链球菌对小鼠的感染实验，证明DNA是遗传信息的载体。1953年Watson和Crick提出DNA右手双螺旋模型，于1962年和Wilkins共享诺贝尔生理医学奖。尔化学奖。1954年Crick提出遗传信息传递的中心法则。贝尔生理医学奖。他们还首次提出了信使核糖酸(mRNA)的存在及作用。同年，Nirenberg等人应用合成的mRNA分子[poly(U)]破译出第一批遗传密码。享了诺贝尔生理医学奖。1967年发现了可将DNA连接起来的DNA连接酶。诺贝尔生理学奖。1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的表达。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。NielsKaiJerne由于发展了单克隆抗体技术而分享了诺贝尔生理医学奖。年Mullis与第一个设计定点突变的Smith共享了诺贝尔化学奖。2002年12月10日第一百零二届诺贝尔奖颁发。美国科学家约翰·芬恩(JohnB．Fenn，美国科Wüthrich)教授因发明了对生物大分子进行确认和结构分析、质谱分析的方法，而共同获得诺贝尔化学奖。2003年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家保罗·劳特布尔和英国科学家彼得·曼斯菲尔德，以表彰他们在核磁共振成像技术领域的突破性成就。他们的成就是医学诊断和研究领域的重大—4—成果。西澳大利亚大学(UWA)临床医学教授－－BarryJ．Marshall，长期从事胃溃疡的临床诊断、治教授共同分享了诺贝尔生理与医学奖。【考试要点】学科发展趋势功能基因组学蛋白质组学及蛋白质功能生物信息学核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸／基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则 蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。三、细胞信号转导的分子生物学细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化。例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。2．基因的研究经历了哪几个阶段？每个阶段的研究内容是什么？—5—3．分子生物学的发展经历了哪几个阶段？4．21世纪分子生物学有怎样的发展趋向？5．下列研究或发明中哪一项未曾获得过诺贝尔奖()CRNAD (南京大学2008年试题)6．请你描述两个经典实验来证明遗传物质是DNA而不是蛋白质。(武汉大学2008年试题)7．述2006年诺贝尔生理学奖的获得者的主要贡献和这一成果的主要应用领域。(16分)(浙江大学2008年试题)【本章小结及复习思路】重点内容：生物学建立的学科基础学的发展历程3．分子生物学研究的主要内容【本章复习思考题】尔、摩尔根和沃森对分子生物学发展的贡献。3．早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？这些实验的主要步骤。—6—第二章染色体与DNA【考情分析】1．重要程度：.....2．常考题型：名词解释、判断、填空、简答、论述、论述4．重难点分析：和原核细胞DNA的复制的差别、DNA的修复和转座。本章难点：准确理解并掌握各概念。【主要内容】第一节第二节第三节第四节第五节第六节染色体原核和真核生物DNA的复制特点【考试要点】染色体概念的建立原核生物染色体【主要内容】二、真核细胞染色体的组成孟德尔的工作被认为是生物学史上最重大的发现之一，然而他的工作在沉没30多年以后才被人们重新发现，这其中非常重要的一点是，在孟德尔时代没有一个人知道基因的物理结构是怎样的，它们位于细胞中的什么地方，它们又是怎样从亲代传到子代的，等等。也就是说至1866年的时候还没—7—有关于染色体、有丝分裂及减数分裂的描述。孟德尔定律重新发现后，有大量的杂交实验证明他的理论是正确的，这样就迫使人们去思考、去研究孟德尔的遗传因子究竟是什么，它的结构是怎样的，它们在细胞的什么地方，细胞中什么样的结构与假设的遗传因子(基因)是相一致的等等。代到一代的传递方式与基因从一代到一代的传递方式有着密切的平行关系。为了解释这种相关性，遗传学发展的重要里程碑正是由于接受了这一概念，即细胞学提供的在显微镜下可以看到的染色体的行为与杂交实验的遗传因子的行为相关联，它标志着遗传学与细胞学的结合。直到今天，这一学说仍然是遗传分析最本质的一部分。染色体—遗传物质的主要载体。染色体在遗传上起着主要作用，因为亲代能够将自己的遗传物质以染色体(chromosome)的形式传给子代，保持了物种的稳定性和连续性。染色质(chromatin)是存在于真核生物间期细胞核内的一种易被碱性染料着色的无定形物质，是DNADNA分子，加上围绕其中的组蛋白和非组蛋白所组成的，是细胞分裂间期遗传物质的存在形式。具有固定形态的遗传物质存在形式，是高度螺旋化的DNA蛋白质纤维。染色质和染色体是真核生物遗传物质存在的两种不同形态，两者不存在成分上的差异，仅反映它们处于细胞分裂周期的不同功能阶段而已。染色体这一概念除指真核生物细胞分裂中期具有一定形态特征的染色质外，现在已扩大为包括原核生物及细胞器在内的基因载体的总称。大部分原核生物的染色体形态比较简单，它只是一条裸露的或与少数蛋白质结合的DNA或RNA双链或单链分子。每一种生物的染色体数目是恒定的。多数高等动植物是二倍体(diploid)，也就是说，每一体细胞如人的染色体是46(2n＝46)，果蝇的染色体是8(2n＝8)。但多数微生物的营养体是单倍体，如链孢霉的单倍体染色体数是7(n＝7)。同一物种内每条染色体所带DNA的量是一定的，但不同染色体或不同物种之间变化很大，比如，人X染色体有1．28亿个核苷酸对，而Y染色体只有0．19亿个核苷酸对。人类22对染色体及性染色体显微结构图人类基因组各条染色体中碱基对数量和推导的功能基因数量对照染色体编号长度(Mbp)估计的基因数123456789—9—续表染色体编号长度(Mbp)估计的基因数XY总长物种单倍体染色体数物种单倍体染色体数人线虫猿猴酵母8左右牛绿藻狗洋葱8猪大麦7马水稻小鼠玉米大鼠龙头花8荷兰猪番茄兔烟草鸡菜豆鳄鱼松树蚕红叶草7淡水螅家蝇6细菌1果蝇4猫狐着丝粒位骆英文名称作为遗传物质，染色体具有如下特征：①分子结构相对稳定；②能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；③能够指导从而控制整个生命过程；④能够产生可遗传的变异。口名词解释1．染色体(浙江大学2001年试题)2．染色质(江苏大学2005年试题)【本讲复习思考题】染色体具备哪些作为遗传物质的特征？染色体的组成真核细胞染色体由DNA和蛋白质两大部分组成。 (一)真核细胞染色体蛋白质口染色体蛋白主要分为组蛋白和非组蛋白两类。AHB之间。#真核细胞染色体组蛋白特性：·进化上的极端保守性。不同种生物组蛋白的氨基酸组成十分相似。牛、猪、大鼠的H4氨酸序列完全相同，与豌豆序列相比也只有两个氨基酸的差异。·无组织特异性只有鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。·肽链上氨基酸分布的不对称性碱性氨基酸集中分布在N端的半条链上，而大部分疏水基团都分布在C端。碱性的半条链易与DNA的负电荷区结合，而另外半条链与其他组蛋白、非组蛋白结合。·存在较普遍的修饰作用如甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。修饰作用只发生在细胞周期的特定时间和组蛋白的特定位点上。种类相对分子质量氨基酸数目分离难易度保守性染色质中比例染色质中比例易不保守接头较难保守1核心较难保守1核心最难保守1核心最难保守1核心口真核细胞染色体上的组蛋白成分分析不同组蛋白分子中所含的碱性氨基酸比较(占氨基酸总数的％)碱性氨基酸H2AH2B赖氨酸精氨酸~100种(常见的有15~20种)，主要包括酶肌蛋白等。 (二)真核细胞染色体DNA真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质xC生物单倍体基因组DNA的总量。各种生物细胞内DNA总量的比较口同类生物不同种属之间DNA总量变化很大。从编码每类生物所需的DNA量的最低值看，生物细胞中的C值具有从低等生物到高等生物逐渐增加的趋势。口真核细胞DNA序列可被分为3类：在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的10％~80％。不重复序列长约750~2000bp，相当于一个结构基因的长度。蛋清蛋白、蚕的丝心蛋白、血红蛋白和珠蛋白等都是单拷贝基因。DNA占非洲爪蟾的rRNA基因结构示意图细胞DNA的75％，从而使该细胞能积累1012个核糖体，以合成大量蛋白质供细胞分裂之需．3．高度重复序列—卫星DNA达数百万次。因为卫星DNA不转录，其功能不详。它们是异染色质的成份，可能与染色体的稳定性有关。 (三)染色质和核小体由DNA和组蛋白组成的染色质纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。口染色质DNA的Tm值比自由DNA高，说明在染色质中DNA极可能与蛋白质分子相互作用。口在染色质状态下，由DNA聚合酶和RNA聚合酶催化的DNA复制和转录活性大大低于在自由DNA中的反应。口DNA酶I(DNaseI)对染色质DNA的消化远远慢于对纯DNA的作用。口用小球菌核酸酶处理染色质以后进行电泳，便可以得到一系列片段，这些被保留的DNA片段均为200bp基本单位的倍数。核小体单元的产生口核心颗粒包括组蛋白八聚体及与其结合的146bpDNA，该序列绕在八聚体外面1．75圈，每圈染色体DNA结构示意图·两段各含10个螺旋的染色质·一个螺旋中包含30个莲座状结构·每个莲座状结构中都有6个环状DNA·每个环状结构中含有75000bp·染色体DNA的念珠状结构·双链DNAm染色体形成过程中长度与宽度的变化宽度增加长度压缩第一级核小体5倍7倍第二级核小体螺线管倍6倍第三级螺线体超螺旋第四级超螺线体染色体5倍的组成原核生物的基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少，如大肠杆菌DNA的相对分子质原核生物基因主要是单拷贝基因，只有很少数基因，如rRNA基因．以多拷贝形式存在；整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。·大肠杆菌细胞中基因组DNA的电镜显微照片(图片见视频)#原核细胞DNA特点：原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有很小一部分控制基因表达的序列不转录。原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部一些细菌和动物病毒存在重叠基因，同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息。1973年，Wein-er和Weber在研究一种大肠杆菌RNA病毒时发现，有两个基因从同一起点开始翻译，一个在400bp，翻译可一直进行下去直到800bp处碰到双重终止信号时才停止毒DNA本身只有5375个核苷酸。Sanger在弄清Φ×174DNA的全部核苷酸序列及各个基因的起迄位骆和密码数目以后发现，9个基因中有些是重叠的。基因重叠可能是生物进化过程中自然选择的结果。口名词解释：1．C值(华中理工大学2001年试题)C国科学院2004年试题、江苏科技大学2006年试题) (浙江大学2006年试题浙江大学2002年试题浙江大学2001年试题)4．组蛋白(江苏大学2005年试题)5．非组蛋白、卫星DNA(江苏科技大学2006年试题)口判断：1．高等生物基因组含有大量的不编码蛋白的序列，因此基因组的大小与其进化程度并不一一对应()(浙江大学2010试题)2．真核生物DNA缠绕在组蛋白上构成核小体，核小体含有的蛋白质是()(中科院2009试题)口填空：1．染色体中DNA与()结合成复合体，并形成串联的()结构。(北京师范大学002试题)2．真核生物核小体的组成是()和()。(北京师范大学2008试题、厦门大学006试题)3．天然染色体末端不能与染色体断裂片段发生连接，这是因为天然染色体末端存在()结构。(中国科学院2008年试题、中国科学院2002年试题、华南理工大学2004年试题)【本讲复习思考题】1．什么是核小体？简述其形成过程。2．简述真核生物染色体的组成及组装过程。3．简述原核生物染色体的特点。【考试要点】#DNA的化学组成、碱基类型#DNA的一级结构DNA的二级结构DNA的高级结构DNA的半保留复制【主要内容】DNA(deoxyribonucleicacid)是一种高分子化合物，其基本单位是脱氧核苷酸。DNA的一级结构是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。在DNA分子中，磷酸和脱氧核糖是不变的，而4种含氮碱基即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)是可变的。2－脱氧核糖(左)和核糖(右)结构式组成DNA分子的4种碱基：胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)图2－2组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式碱基核苷核苷酸NA在DNA分子中，嘌呤永远与嘧啶配对，而且腺嘌呤(A)只能与胸腺嘧啶(T)配对，鸟嘌呤(G)只能与胞嘧啶(C)配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。DNA链的基本特点是：1．DNA是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。3．两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对。—20—DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在。DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。表2－8不同螺旋形式DNA分子主要参数比较双螺旋碱基倾角(度)每轮碱基数螺旋方向右6右7左口DNA二级结构中左手螺旋—Z－DNA的研究B－DNA是最常见的DNA构象，A－DNA和Z－DNA可能具有不同的生物活性。口Z－DNA调控基因转录的两个模式在邻近调控系统中，与调节区相邻的转录区被Z－DNA抑制，只有当Z－DNA转变为B－DNA—21—化。口在远距离调控系统中，Z－DNA可通过改变负超螺旋水平，决定聚合酶能否与模板链相结合而调节转录起始活性。DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互变，如：研究细菌质粒DNA时发现，天然状态下该DNA以负超螺旋为主，稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则呈线性结构。在电场作用下，相同分子质量的超螺旋DNA比线性DNA迁移率大，线性DNA又比开环的DNA迁移率大，以此可判断质粒结构是否被破坏。【经典试题】口填空题1．组成DNA的基本单位是()，组成RNA的基本单位是()。(浙江大学2010试题)2．DNA的左手螺旋是()型DNA，对于表达调控有一定的作用。(南开大学2009试题)口选择题√下列关于DNA的某些描述，正确的是()。(清华大学2006年试题，四川大学2006年试题)A．迄今发现的DNA分子都是双股的B．反向平行的双股DNA意味着两条链的碱基组成是相同的—22—C．在相对分子质量相同的条件下具有超螺旋结构的DNA分子浮力密度最大D．DNA的每个戊糖分子上有一个自由的羟基【考试要点】DNA的半保留复制DNA复制的起点DNA复制的方向DNA复制的速度【主要内容】生命的遗传实际上是染色体DNA自我复制的结果，而染色体DNA的自我复制主要是通过半保由于DNA是遗传信息的载体，因此亲代DNA必须以自身分子为模板来合成新的分子—准确地复制成两个拷贝，并分配到两个子代细胞中去，才能真正完成其遗传信息载体的使命。由于DNA分子由两条多核苷酸链组成，两条链上的碱基—G只能与C相配对，A只能与T相配对，所以，两条链是互补的，一条链上的核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序。DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。留复制。DNA的半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性，与DNA的遗传功能相符合。由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此在复制叉附近解开的DNA链一条是5’→3’方两条链无法同时进行复制。为了解释DNA的等速复制现象，日本学者冈崎(Okazaki)提出了DNA的半不连续复制模型。半不连续复制Semi－—23— (1)用3H脱氧胸苷短时间标记后提取DNA，得到不少平均长度为2－3kbDNA片段。 (2)用DNA连接酶温度敏感突变株进行实验，在连接酶不起作用的温度下，有大量小片段累积，说明复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再生成大分子DNA。 (3)前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为DNA的半不连续复制。DNARep-口DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子replicon)，一个—24—复制子只含一个复制起点。表2－9部分生物复制子的比较物种细胞内复制子数目(个)复制子移动速度－1(bp·min)大肠杆菌1酵母？果蝇蟾蜍蚕豆？口细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的；口真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。·放射自显影技术表明染色体复制子为双向复制。实验结果表明，无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。·放射性标记实验证明DNA的复制是从固定的起始点双向等速进行的．A．DNA仅用[3H]胸腺嘧啶标记10min即压X光片；B．DNA在[3H]标记10min后又继续非标记合成10min，导致X光片上的复制叉变长，银颗粒分布广而稀少。—25—1．线性DNA双链的复制2．环状DNA双链的复制 (1)θ型 (3)D－环型(D－loop)环状DNA双链的复制－θ型图2－19大肠杆菌质粒DNA双向复制的模式与实验验证上：θ形复制模式图；—26—Dloop是单向复制的特殊方式。首先在动物线粒体中被发现。一条短RNA与一条DNA互补，取代了该区域原来的互补的DNA链，使得两条链的合成高度不对称，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则为游离的单环。口名词解释2．负超螺旋、正超螺旋3．拓扑异构酶(江苏大学2005年试题)4．Z型DNA(第一军医大学2003年试题)口填空√DNA高级结构的主要形式是()结构，可以分为()和()两大类。(中国科学院2003试题)√选择题：关于DNA的超螺旋结构正确的表达是()。(华中科技大学2004年试题)A自然界中只存在负超螺旋C．线性DNA在任何时候都不会出现超螺旋结构D构不会改变DNA的缠绕数【本讲复习思考题】2．原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征3．简述DNA双螺旋结构及其在现代分子生物学中的意义。4．DNA复制的主要方式有哪些？—27—真核生物DNA复制的特点【考试要点】原核生物DNA复制的过程ColEl质粒真核生物DNA复制控制机制【主要内容】大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，其DNA复制的中间产物可形成一个θ，复制从定点开始双向等速进行，复制起始区位于其遗传图的84min附近。复制起始后，两个复制叉在距起始点180°处会合。A首先，在拓扑异构酶Ⅰ的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。解链过程中必需有SSB蛋白来稳定已解开的单链，以保证该局部结构不会恢复成双链。接着，由引发酶等组成的引发体迅速作用于两条单链DNA上。不论是前导链还是滞后链，都需要一段RNA引物以开始子链DNA的合成。由大肠杆菌oriC复制起始点处引发的DNA复制过程—28—·大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4各9bp保守序列相结合。·DnaB(解链酶)六体分别与单链DNA相结合(需要DnaC的帮助)进一步解开DNA双链。·与引物结合，起始DNA复制。 (1)单链结合蛋白(SSB蛋白)口T4噬菌体的32kDa蛋白可以结合单链DNA，它还能使双链DNA在远低于解链温度时分开。大部分原核SSB蛋白与DNA结合时还表现出协同效应：NA (2)DNA解链酶(DNAhelicase)大部分DNA解链酶都沿滞后链模板的5’→3’方向并随着复制叉的前进而移动，只有Rep蛋白沿前导链模板的3’→5’方向移动。因此，Rep蛋白和其他DNA解链酶分别在DNA的两条母链上协 (3)DNA拓扑异构酶消除解链造成的正超螺旋的堆积，使复制得以延伸。开始的呢？口研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。组装后形成引发体，才能发挥其功能。—29—引发体在滞后链分叉的方向上前进，并在模板上间断性引发生成滞后链引物—RNA短链，再由DNA聚合酶Ⅲ作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNaseH降解RNA引物并由DNA聚合酶I将缺口补齐，再由DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。链的终止需要Tus蛋白参与．当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列(Ter)时，Ter－Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶Ⅳ的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ－－新生链合成－－相对分子质量3(×10)细胞内分子数？生物学活性1已知的结构基因Pol(A)Pol(B)#DNA聚合酶的共同点：3．聚合时必须有模板链和具有3′—OH末端的引物链。4．链的延伸都方向为5′→3′。DNA聚合酶Ⅰ不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有5’→3’核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。它也可用来除去冈崎片段5‘端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶—30—将片段连接起来。DNA活性很低，若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA的转化率计算，只有DNA聚合酶Ⅰ的5％，所以也不是复制中主要的酶。目前认为DNA聚合酶Ⅱ的生理功能主要是起修复DNA的作用。DNA聚合酶Ⅲ包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它的聚合活性苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。真核生物DNA的复制子长约150bp左右，包括数个复制起始必需的保守区。DNAbpDNA000－300，000bp就有一个复制起始位点。真核生物DNA聚合酶的特性比较性质DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亚基数412≥1在细胞内分布核内核内线粒体核内功能DNA引物合成损伤修复线粒体DNA复制主要DNA复制酶3′→5′外切无无有有有5′→3′外切无无无无无口DNA聚合酶α主要参与引物合成。口DNA聚合酶β活性水平稳定，主要在DNA损伤的修复中起作用。口DNA聚合酶δ是主要负责DNA复制的酶。口DNA聚合酶ε的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。DNA链延伸的速度在同种生物的不同细胞中几乎是恒定的，只是复制叉的数量不同。迅速分裂的细胞具较多的复制叉，而分裂缓慢的细胞复制叉较少并出现复制的间隙。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和RNA。ColEl质粒DNA的复制调控—31—ColEl有20~30个拷贝，其DNA的复制完全依靠宿主DNA聚合酶。质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA(RNA1)，它们控制了起始DNA复制所必需的引物合成。ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系RNARNaseH然后由DNA聚合酶I在引物的3’末端起始DNA合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5’末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5’末端互补，并通过氢键配对与后者相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起调控作用。Rop蛋白是RNA1基因转录的激活因子。大肠杆菌染色体DNA的复制调控口染色体的复制与分裂一般是同步的，但二者并不直接偶联。口在一定生长速度范围内，细胞与染色体的质量之比相对恒定。口复制子由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制体调节蛋白，复制起点与调节蛋白相互作用并启动复制。调节蛋白通过与复制复合物的相互作用确定复制起始频率和复制方式。口复制起点有OriC和OriH两种。真核细胞DNA的复制调控口细胞生活周期水平调控(限制点调控)：决定细胞停留在G1期还是进入S期(byCyclins，Cdc 口染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。口复制子水平调控：决定复制的起始与否，并且是高度保守的。口判断题大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ合成DNA的连续性较DNA聚合酶Ⅰ好。()(南开大学2008年试题)—32— [解析]化效率中等，主要负责DNA修复和除掉RNA引物；DNA酶Ⅱ催化效率最低，主要负责修口选择题√识别大肠杆菌DNA复制起始区的蛋白质是()。(厦门大学2006年试题)口填空题1．DNA复制时的RNA引物是由()的()活性切除的。(南京大学2003年试题)：DNA聚合酶I5’→3’核酸外切酶活性2．DNA复制过程中负责单链不被降解的酶是()。(南京大学2003年试题)【本讲复习思考题】2．真核生物DNA的复制在那些水平收到调控？【考试要点】#DNA损伤的几种类型#错配修复、切除修复、重组修复的修复机制#DNA的直接修复【主要内容】—33—由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复就有着特别重要的意义。大肠杆菌中DNA的修复系统DNA修复系统功能错配修复恢复错配碱基切除修复切除突变的碱基核苷酸切除修复修复被破坏的DNADNA直接修复修复嘧啶二体或甲基化DNADNA达102－103，DNA子链中的错配几乎完全能被修正。—34—图2－25根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图。a．发现碱基错配。b．在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配位点的DNA双链相结合。c．MutS－MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链。DamGATC酸的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的几秒种至几分钟内被甲基化。错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5’位骆切开子链，再启动特定的修复途径，合成新的子链片段。图2－26碱基错配修复过程示意图—35—链片段。若错配碱基位于切口的5’上游端，则在DNA外切酶Ⅰ或X的作用下切除单链DNA直到错配位点，再合成新的子链片段。口切除修复有2种：碱基切除修复和核苷酸切除修复口所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的不同的糖苷水解酶，能特异性切除受损核苷酸上的N－β糖苷键，形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。图2－27DNA分子中常见的几种核苷酸非酶促转变反应a基反应—36—b．脱嘌呤反应(N－β糖苷键被水解)DNA分子中一旦产生了AP位点，内切酶就会把受损核苷酸的糖苷－磷酸键切开，移去AP位点附近小片段DNA，并由DNA聚合酶I和DNA连接酶共同完成修复。—37—当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。，移去AP位点附近小片段DNA，并由DNA聚合酶I和DNA连接酶共同完成修复。大肠杆菌和人类细胞中的核苷酸切除修复过程示意图重组修复又称为“复制后修复”。机体细胞对在复制起始后尚未修复的DNA损伤部位可以先复制再修复。生物体内还存在DNA损伤直接修复而并不需要切除碱基或核苷酸的机制。DNA光解酶(photolyase)能把在光下或经紫外光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6－4光化物 t图2－29紫外光诱发形成嘧啶二体—38—此外，生物体内还广泛存在着使O6－甲基鸟嘌呤脱甲基化的甲基转移酶。1．影响DNA损伤的因素是什么？说明修复机制对生物体的意义。(中国科学院2010年试题)3．试述环境因素对DNA的损伤以及生物体中存在的DNA损伤修复系统。如果DNA损伤没有试题)【考试要点】转座转座子可移位因子IS因子【主要内容】口转座子的分类和结构特征口转座作用的机制口转座作用的遗传学效应口真核生物中的转座子一、转座子的分类和结构特征现象。转座子分为2大类：插入序列和复合式转座子。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称常带有少于10个IS序列。IS因子：常见的IS序列都是很小的DNA片段(约1kb)，末端具有倒置重复序列，转座时常复制宿主靶位点4~15bp的DNA形成正向重复区。大部分IS序列只有一个开放读码框，翻译起点紧挨着第一个倒置重复区，终止点位于第二个倒置重复区或附近。IS1含有两个分开的读码框，只有移码通读才能产生功能型转座酶。—39—IS序列的结构特征比较长度(bp)两端倒置重复区(bp)靶位点正向重复区(bp)靶位点9随机5有热点4有热点999有热点9未知复合式转座子：复合式转座子(compositetransposon)是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。TnA家族：A除了末端带有IS序列的复合转座子以外，还存在一些没有IS序列的、体积庞大的转座子(5000bp以上)—TnA家族。常带有3个基因，一个编码β－内酰胺酶(AmpR)，另两个则是转座作用所必须的。所有TnA类转座子两翼都带有38bp的倒置重复序列。转座发生时，受体分子中有一段很短的(3~12bp)、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但特定转座子所复制的靶序列长度是一样的。IS1两翼总有9个Tnbp在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶(transposase)和解离酶(resolvase)分别作用于原始及复制转座子。TnA类主要是这种形式。个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。—40—学效应①转座引起插入突变，导致结构基因失活；②转座产生新的基因；③转座产生的染色体畸变；④转座引起生物进化。由于转座作用，使某些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成新的表达单元，产生新的基因和蛋白质分子。玉米中转座子的控制因子分为两类，即自主性因子和非自主性因子。前者具有自主剪接和转座的功能；后者单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能。同一家族的自主性因子能为非自主性因子的转座提供反式作用蛋白(转座酶)。酶)两翼有11bp的倒转重复序列，在其靶DNA位点复制形成8bp正向重复。已知所有Ds都是Ac转座子的缺失突变体，其两端有完整的转座特征序列。是切割转座子序列。另有两个开放读码框位于tnpA基因的内含子中，其mRNA的含量大约只有tnpAtnpB13bp倒转重复区相结合，有fectiveSpmSpm—41—2．果蝇中的转座子果蝇中的Copia转座子具有数百bp的末端正向重复和类似于酵母Ty转座子及RNA肿瘤前病毒的结构，能以高速度转录并产生有多聚腺苷化末端的RNA。只具有一个长的可阅读框架，基因产物与RNA肿瘤病毒逆转录酶有较高的同源性。图2－37真核生物细胞内存在不少结构上类似于反转录病毒的反转录转座子。这类转座子都编码一个与反转录病毒中的反转录酶高度同源的转座酶，左右两边都是与病毒边界序列LTR同源的重复序列。·P转座子P转座子(Pelement)属于非复制型，两翼都有31bp倒置重复序列，转座后导致靶DNA复制产生8bp正向重复序列。有实验证明，P转座子插入果蝇基因组W位点引起杂种不育。【本讲复习思考题】 (1)什么是转座子，可分为哪些种类？ (2)试比较插入序列与复合型转座子的异同。口问答题1．简述真核生物组蛋白的种类、特性，组蛋白修饰的种类及其生物学意义。(中科院2003年试题)2．简述真核生物细胞内核小体与核小体颗粒的结构。(中科院上海生命科学研究院2002年试题)3．简述DNA的结构。(浙江大学2000年试题)4．Waston和Crick提出的DNA双螺旋模型内容和证据。(浙江大学2000年试题)5．假如你从一新发现的病毒中提取了核酸。请用最简单的方法确定：(1)他是DNA还是RNA？ (2)他是单链还是双链？ (江苏大学2006年试题)解析： (2)鉴定单链还是双链：测定不同碱基所占比例；测定加热(80度)前后260nm吸收值。—42—【本章小结及复习思路】本章即第二章染色体与DNA是分子生物学最基础的知识与理论，也是各校考试的重点。。复习的关键点：·染色体的概念、真核细胞染色体的组成NA·转座子的分类和结构特征、作用机制、遗传学效应—43—第三章生物信息的传递(上)—从DNA到RNA【考情分析】1．重要程度：.....DNA到RNA—转录的基本过程、转录机器的结构、转录涉及的酶、转录的产物。A清楚记忆。【主要内容】第一节第二节第三节第四节第五节启动子与转录起始原核与真核生物mRNA的特征比较终止和抗终止内含子的剪接编辑再编码及化学修饰【考试要点】RNA转录的过程：。转录机器的组成与结构【主要内容】要成分 (2)T淋巴细胞及其发育和分化 (3)免疫球蛋白的结构 (4)免疫球蛋白的基因结构第十一章基因组与比较基因组学【考情分析】1．重要程度：...本章重点：理解并掌握高通量DNA序列分析技术，人类基因组计划和比较基因组学及功能基因组学研究【主要内容】第一节高通量DNA序列分析技术第二节人类基因组计划第三节比较基因组学及功能基因组学研究【考试要点】鸟枪法双脱氧链终止法酵母人工染色体技术(YAC)BAC【主要内容】三、鸟枪法序列测定技术及其改良无论是对于重组质粒、单个基因还是整个基因组，分析DNA结构的最基本方法就是测定出这些DNA分子的一级结构—DNA序列。DNA自动测序仪可快速测定DNA序列，计算机处理能力的快速提高则使得大量DNA小片段很容易拼接成较大的片段甚至整个染色体。止法和Maxam－Gilbert的化学修饰法。后者因更适应序列分析的自动化而逐渐占据优势。YAC：着丝粒、端粒和复制起点。用细菌的F质粒及其调控基因构建细菌染色体克隆载体，称为BAC(Bacterialartificialchromo-贝数)等成分。三、鸟枪法序列测定技术及其改良受序列分析技术限制，一次测序的长度不能超过1kb，目前往往采用所谓的全基因组鸟枪法测序技术，随机挑选插入基因组DNA的质粒做测序反应，然后用计算机程序进行序列拼接(图11－14)。图11－14基因组DNA的鸟枪法测序原理示意图口鸟枪法测序的缺点：随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各个片段重叠成一个连续体的概率是2n2－2n。其次，高等真核生物(如人类)基因组中有大量重复序列，导致判断失误(图11－15)。图11－15鸟枪法测序技术不能鉴别高等真核生物基因组中的重复序列口对鸟枪法的改进：－大片段克隆法Clonecontig法。首先用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。－靶标鸟枪法(diretedshotgun)。首先根据染色体上已知基因和标记的位骆来确定部分DNA片段的相对位骆，再逐步缩小各片段之间的缺口。对于DNA测序的技术只能一次测序大约1kb左右的DNA序列，可是人类的DNA全长大约为30亿个，大约是300万个1kb的集合。如果DNA测序能够沿模板次序进行，一次1kb可能也不是问题，只不过重复的次数多了些。事实上，每次测序是在染色体DNA中随机取一小段，因此，把这些随机的小片段按原样拼接产生完整的DNA序列就成为基因序列分析中亟需解决的最关键的问题。【考试要点】#基因组学#基因组#RFLP【主要内容】一、人类基因组计划的科学意义omics一道问世，它着眼于研究并解析生物体整个基因组的所有遗传信息。基因组是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。人类基因组23对染色体，单倍体细胞中约有30亿对核苷酸，编码了5－6万个基因，人类基因组中携带了有关人类个体生长发育、生老病死的全部遗传信息。的。当然，不同的人可能拥有不同的等位基因，这一点决定了人与人之间个体上的差异。一、人类基因组计划的科学意义大肠杆菌等上百个原核生物基因组。人类基因组计划的科学意义在于： (1)确定人类基因组中约3－4万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。 (2)了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。 (3)从整体上了解染色体结构，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。 (4)研究空间结构对基因调节的作用。 (5)发现与DNA复制、重组等有关的序列。 (6)研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，为疾病诊断、预防和治疗提供理论依据。 (7)确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。 (8)研究人类个体之间的多态性(SNP)情况，用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。人类基因组计划的成果是多方面的，它主要体现在鉴定基因的四张图上。遗传图(GeneticMap)又称连锁图(LinkageMap)，是指基因或DNA标志在染色体上的相对位骆与遗传距离，通常以基因或DNA片段在染色体交换过程中的分离频率厘摩(cM)来表示。cM值越两者之间距离越远。产生配子的减数分裂过程中，亲代同“号”的父源或母源染色体既能相互配对也可能发生片段互换，而父母源染色体等位基因互换导致子代出现DNA“重组”的频率与这两个位点之间的距离呈正相以，用两个位点之间的交换或重组频率来表示其“遗传学距离”。性)。DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。口第二代DNA遗传标记利用了存在于人类基因组中的大量重复序列：－重复单位长度在15－65个核苷酸左右的小卫星DNA；－重复单位长度在2－6个核苷酸之间的微卫星DNA ？第三代DNA遗传标记，可能也是最好的遗传标记，是分散于基因组中的单个碱基的差异，即单核苷酸的多态性(SNP)，包括单个碱基的缺失、插入和替换。SNP中大多数为转换，即由一种嘧啶碱基替换另一种嘧啶碱基，或由一种嘌呤碱基替换另一种嘌SNP有可能在密度上达到人类基因组“多态”位点数目的极限。估计人类基因组中可能有300万SNP与RFLP和STRP标记的主要不同之处在于，它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记。“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点，相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区，并分别设骆了“标牌”。如果在家系中证实该基因与某个标记不连锁(重组率为50％)，表明该基因不在这一标记附近。如果发现该基因与某个标记有一定程度的“连锁”(重组率小于50％但大于0)，表明它可能位于这个标记附近。如果该基因与某标记间不发生重组(重组率等于0)，我们就推测该标记与所研究的疾病基因可能非常接近。ontigsquencetag)是人类基因组图的雏型。在成年个体的每一特定组织中，一般只有10％~20％的结构基因(约1~2万个不同类型的mR-NA)表达。人类基因组的核苷酸序列图是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。测定总长约1米、由30亿个核苷酸组成的全序列是人类基因组计划的最终目标。不同种族、不同个体的基因差异(基因组的多样性)以及“正常”与“疾病”基因的差异，只是同一口名词解释基因组学(南开大学2006年试题)口选择题关于基因组的描述，正确的是(A)A．每种生物都有各自的基因组B．爬行类的基因组大于灵长类的D．脊椎动物的基因组是相同的 (深圳大学2009年试题)口判断题基因组是细胞内所有基因的组合。() (南开大学2003年试题)【本讲复习思考题】1．简述人类基因组计划的科学意义。2．区分遗传图谱和物理图谱，试述这两项技术的优缺点。3．鸟枪测序法的技术原理是什么？【考试要点】#比较基因组学#功能基因组学#cDNARACE(cDNA末端快速扩增)【主要内容】一、通过基因组数据进行全局性二、通过基因组数据进行比较基因组学研究rativegenomics (1)通过比较确知其生理功能的； (2)在数据库中有相匹配的蛋白质序列，但并不知道其功能的； (3)在现有数据库中找不到任何相匹配的蛋白质序列的新基因。一、通过基因组数据进行全局性低等真核生物如酵母、线虫以及高等植物拟南芥，不但基因组比较小，基因密度比较高，百万碱基对中含有200个或更多的基因，基因组90％以上由常染色质组成。图11－17部分典型真核和原核生物基因组成份分析A．人β－T细胞受体位点，在50kb大片段中只有一个基因(TRY4，编码胰蛋白酶原)，一个假基TRYVV个存在于全基因组范围内的重复序列，编码功能基因的序列占总序列不到3％。组中，一共只有239个内含子，而一个人类基因就可能有多达100个内含子。FthrAthrBthrC因直接位于thrB终止子的下游。原核生物基因中没有内含子(少数古细菌基因中可能存在极少的内含子)。原核基因组中没有重果蝇和人类基因组中异染色质的比例较高，占基因组的20％~40％。研究果蝇核DNA发现，其Y染色体几乎完全异染色质化，第四号染色体也大部分被异染色质化，其X染色体在不同家系中变化图11－18