T-ZNZ 235-2023 水产养殖环境中地西泮残留量的测定 液相色谱串联质谱法

CCSB50T/ZNZchromatography-tandemmassspectrometri浙江省农产品质量安全学会发布IT/ZNZ235—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省农产品质量安全学会提出并归口。本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站（浙江省渔业检验检测与疫病防控中心）。本文件主要起草人：王鼎南、周钦、王扬、李诗言、柯庆青、周凡、吴洪喜、吴平谷。1T/ZNZ235—2023水产养殖环境中地西泮残留量的测定液相色谱串联质谱法本文件规定了水产养殖环境中地西泮残留量的液相色谱串联质谱法测定方法。本文件适用于水体和底泥等水产养殖环境中地西泮残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T9102.1渔业生态环境监测规范第1部分：总则SC/T9102.2渔业生态环境监测规范第2部分：海洋SC/T9102.3渔业生态环境监测规范第3部分：淡水3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理在弱碱性环境下，将水体样品或底泥样品中的地西泮用乙酸乙酯萃取，经浓缩和PSA净化材料净化后，用液相色谱-串联质谱仪检测和确证，内标法定量。5试剂和材料5.1试剂5.1.1乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。5.1.2乙腈（C2H3N）：色谱纯。5.1.3甲醇（CH4O）：色谱纯。5.1.4甲酸（CH2O2）：色谱纯。5.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）：使用前需550℃高温灼烧4h。5.1.6无水磷酸氢二钾（K2HPO4）。5.2溶液配制5.2.180%乙腈水溶液：准确量取800mL乙腈（5.1.2），用水定容至1L，混合均匀后备用。2T/ZNZ235—20235.2.20.1%甲酸水溶液：准确量取1mL甲酸（5.1.4），用水定容至1L，混合均匀后备用。5.2.31mol/L磷酸氢二钾溶液：准确称取174g磷酸氢二钾（5.1.6），用适量水溶解后，定容至1L容量瓶中，混合均匀后备用。5.3标准品5.3.1地西泮标准物质：CAS号：439-14-5，纯度≥95%。5.3.2地西泮-D5内标物：CAS号：65854-76-4，纯度≥95%。5.4标准溶液配制5.4.1地西泮标准储备液（100μg/mL）：准确称取10mg（精确至0.1mg）地西泮标准物质，用乙腈（5.1.2）溶解并定容至100mL，-20℃避光保存，有效期6个月。5.4.2地西泮标准中间液（10.0μg/mL）：准确移取1mL地西泮标准储备液（5.4.1）于10mL容量瓶中，用乙腈（5.1.2）稀释定容，配制成浓度为10.0μg/mL的标准中间液，-20℃避光保存，有效期6个5.4.3地西泮标准工作液（100ng/mL）：准确移取1mL地西泮标准中间液（5.4.2）于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.2）稀释定容，配制成浓度为100ng/mL的标准工作液，-20℃避光保存，有效期6个5.4.4地西泮-D5内标工作液（500ng/mL）：将地西泮-D5内标物（5.3.2）用乙腈（5.1.2）逐级稀释至500ng/mL，-20℃避光保存，有效期6个月。5.5材料5.5.1净化材料：N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）。5.5.2微孔滤膜：0.2μm，有机型或亲水亲脂两用型。5.5.3载气：氮气纯度≥99.99%。6仪器和设备6.1液相色谱串联四极杆质谱仪：配电喷雾离子源。6.2分析天平：感量0.01g和0.1mg。6.3涡旋振荡仪。6.4离心机：转速不低于4500r/min。6.5旋转蒸发仪。6.6氮吹浓缩仪。6.7机械真空泵。6.8微量移液器。6.9冷冻干燥机：冷冻温度≤-50℃,真空度＜20Pa。6.10采泥器。6.11筛网：100目。7样品采集、制备及保存按照SC/T9102.1、SC/T9102.2和SC/T9102.3规定的方法采集样品。3T/ZNZ235—2023a）水体样品：500mL棕色玻璃瓶采集，采样时注满容器，避光室温保存，7d内完成萃取。b）底泥样品：剔除石块和植物体后用冷冻干燥机冷冻干燥，用研钵研磨后过100目筛网，-20℃以下冷冻保存，1个月内完成分析。8试验步骤8.1样品萃取及净化8.1.1水体样品取100mL水体样品于250mL分液漏斗中，加入内标100μL（5.4.4），再加入10mL磷酸氢二钾溶液（5.2.3），50mL乙酸乙酯（5.1.1），经过振荡提取后，弃去大部分的下层水相，将上层乙酸乙酯和少量水体样品转移至50mL离心管中，3000r/min离心5min，移取上层清液于150mL鸡心瓶中，38℃下旋转蒸发至近干，在鸡心瓶加入80%乙腈水溶液（5.2.1）1mL和PSA（5.5.1）100mg，旋涡1min，过0.2μm滤膜（5.5.2）供测定。8.1.2底泥样品取试样，常温自然解冻后，称取2g（准确至0.01g）底泥样品于50mL离心管中，加入内标100μL（5.4.4）静置30min，再加入10mL磷酸氢二钾溶液（5.2.3）和10mL乙酸乙酯（5.1.1），适当涡旋后加入5g无水硫酸钠（5.1.5），充分振荡后4500r/min离心5min，移取上层清液至10mL玻璃离心管中，氮吹吹干后，加入80%乙腈水溶液（5.2.1）1mL和PSA（5.5.1）100mg，旋涡1min，过0.2μm滤膜（5.5.2）供测定。8.2仪器参考条件8.2.1液相色谱参考条件液相色谱参数参考条件：a)色谱柱：C18柱，1.8μm，3.0mm×100mm，或性能相当者；b)流动相：甲醇（5.1.3），0.1%甲酸水溶液（5.2.2），梯度洗脱条件见表1；c)流速：300μL/min；d)柱温：40°C；e)进样量：5μL。表1液相色谱的梯度洗脱条件8.2.2质谱参考条件4T/ZNZ235—2023质谱参靠条件：a）离子源：电喷雾离子源；b）扫描模式：正离子扫描（ESI+）；c）监测方式：多重反应监测（MRM）；d）电喷雾电压（IS）：5500V；e）离子源温度（TEM）：550℃;f）气帘气压力（CUR）：35psi；g）雾化气压力（GS1）：55psi；h）辅助气压力（GS2）：60psi；i）碰撞气流速（CAD）：Medium。j）质谱参数见表2。表2地西泮及地西泮-D5的定性离子、定量离子、去簇电压及碰撞能量8.3标准曲线的制备精密量取标准工作液（5.4.3）和内标工作液（5.4.4）适量，经氮气吹干后，用80%乙腈水溶液配制成地西泮浓度分别为0.1ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL系列标准工作液（地西泮-D5内标浓度为50ng/mL）。分别以地西泮浓度为横坐标（x），地西泮的峰面积和内标地西泮-D5峰面积比值为纵坐标（y）绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。8.4测定8.4.1定性测定在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液的保留时间的偏差在±2.5%之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差>50±20±25±308.4.2定量测定5T/ZNZ235—2023取试样溶液和标准工作液，作多点校准，地西泮以地西泮-D5为内标，以色谱峰峰面积定量，内标 法计算。标准溶液及试样溶液中目标药物的特征离子质量色谱峰峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。8.5空白实验除不加试样外，按8.1~8.4的规定执行试剂空白结果。9结果计算和表述9.1水体样品结果计算按式（1）计算水体样品中地西泮残留量。（1）式中：X1—水体样品中地西泮残留量，单位为纳克每升（ng/Lc0—试剂空白结果，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c1—从标准曲线上得到的样液中地西泮的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V1—样品的最终定容体积，单位为毫升（mLV2—水体样品的取样体积，单位为毫升（mL）。9.2底泥样品结果计算按式（2）计算底泥样品中地西泮残留量。（2）式中：X2—底泥样品中地西泮残留量，单位为微克每千克(μg/kgc0—试剂空白结果，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c2—从标准曲线上得到的样液中地西泮的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V3—样品的最终定容体积，单位为毫升（mLm—底泥样品取样质量，单位为克（g）。9.3结果表述测定结果保留小数点后一位。10检测方法灵敏度、精密度、准确度10.1检出限和定量限本方法水体样品中地西泮的检出限为0.3ng/L，定量限为1.0ng/L；底泥样品中地西泮的检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg。6T/ZNZ235—202310.2准确度本方法在水体样品中地西泮加标浓度为1ng/L~500ng/L时，回收率为70.0%~120%；底泥样品中