α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定

α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛、复筛及酶活力测定

目的要求了解利用微生物摇瓶发酵初筛、复筛的目的及要求，其基本原理及方法。了解摇瓶发酵培养的原理、要求和方法技术。了解液体摇瓶发酵用培养基的配制要求。进一步熟悉掌握碘比色法（部颁标准）测定α-淀粉酶活力的原理和方法步骤。基本原理摇瓶培养发酵技术是在抗生素生产的需求条件下发展而来的——需求增加，规模扩大，产量增加，调控控制。浅层培养发酵→深层培养发酵（实验室、工业生产）根据用途配制含有适合营养基质的液体培养基细胞悬浮于相应液体培养基质中，通过振荡，细胞得到充分溶解氧，接触较为新鲜的均匀营养物质，细胞代谢活性较高。发酵培养基（8瓶/组）

（100mL装于500mL三角瓶）玉米淀粉（可溶性淀粉）1g；豆粕粉3g；Na2HPO4.12H2O0.8g；（NH4）2SO4

0.4g；NH4Cl0.15g；CaCO30.10g水100mL121.3℃灭菌20分钟初筛和复筛所需要的一起准备配制。发酵培养基配制说明三角瓶规格要统一。先将不溶解的淀粉、豆粕粉、CaCO3分别称于500mL三角瓶。将无机盐称量后先溶解于水中（在1000mL三角瓶中配制1000mL），调节pH为7.0~7.5，再用量筒量取100mL分别加于500mL三角瓶中，轻摇混匀。121.3℃灭菌20分钟灭完菌后取出，要马上轻摇混匀（？）。种子培养基

（复筛和正交试验使用）玉米淀粉（可溶性淀粉）10g；Na2HPO4.12H2O8g；（NH4）2SO4

4g；NH4Cl1.5g；3%豆粕粉浸出液1000mL煮沸使淀粉溶解后，取50mL分装于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分装于18×180mm试管中（7支），加塞包扎（本学期不使用，不需准备）。121.3℃灭菌20分钟液体接种用种子菌液制备划线接种斜面，30℃培养7天以上备用（充分产芽孢）。复筛试验用：

挑取斜面菌种2环，洗涤于10mL无菌水中，制成菌悬液备用接种，接种前制备。正交试验用：30mL无菌水洗涤斜面（1支），制成菌悬液备用接种，接种前制备。其它器材1mL无菌吸管10支（本学期不需要准备）2mL无菌吸管4支。分别标记清楚。10mL无菌水1支，装于18×180mm试管（全班统一包扎灭菌）。30mL无菌水2瓶装于250mL三角瓶中，包扎，121.3℃灭菌20分钟备用。摇瓶发酵初筛方法及步骤发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种一环上周培养好的斜面菌种（1瓶/株）。37℃摇瓶培养（往复式，110转/分钟）3天。3天后小漏斗加少许脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）——先测原发酵液、低于5min的稀释后重测（2、5、10倍，控制终点反应时间为5-10min）。根据结果选出1~2株进行下周的复筛试验。初筛接种培养时间星期二下午班次：星期二（3月19日）16：00~16：30；星期四上午班次：星期四（3月21日）11：00~11：30星期四下午班次：星期四（3月21日）16：00~16：30初筛和复筛试验接种培养测定时间安排班次初筛接种时间初筛测定时间复筛菌种活化接种时间复筛接种时间复筛测定时间星期二下午星期二16:00星期五8:30星期五10:30下周星期二14:00下周星期五8:30星期四上午星期四11:00星期六8:30星期六10:30下周星期四8:30下周星期六8:30星期四下午星期四16:00星期六10:30星期六12:00下周星期四10:30下周星期六10:30下周斜面接种于液体三角瓶的步骤和要求具体步骤先将接种环制好（直、环平、环稍小——直径小于φ3mm）；挑取斜面菌种满环（要求各瓶尽量一致，以第一瓶作为标准）；无菌操作取下三角瓶瓶布（连同包扎报纸，拿于手中），将接种环上的菌种涮洗于液体培养基中（液体培养基中摩擦瓶壁）；盖瓶布（不要包扎报纸），捆扎好；放在摇瓶机上（注意不要损坏三角瓶），120转/分，37℃往复振荡培养2~3天。发酵液处理发酵液漏斗加棉花过滤；发酵液稀释10倍；测定-酶淀粉酶活力单位；需要2%淀粉溶液3升/25组（20×4×25=2000mL），pH6.0缓冲液1升/25组（5×4×25=500mL）初筛使用挑取的斜面菌种直接接种（1瓶/株），37℃，往复摇瓶机110-120转/分钟，培养2-3天，斜面菌种继续保藏；复筛使用的是初筛酶活力最大的菌株，先液体培养基活化18~24小时（37℃，旋转摇瓶机100-150转/分钟），接种量2mL/瓶（3-4瓶/株）

，37℃，往复式摇瓶机110-120/分钟，培养3天；同时进行斜面直接接种对照培养（条件同上）。摇瓶发酵复筛试验的菌种活化

（？）复筛菌种活化培养时间要求：上课前一天中午12：45~13：30，斜面菌种接种于种子培养基（50mL），37℃摇瓶培养。培养时间：18~24小时摇瓶发酵复筛试验的安排和步骤当天上课时间制备发酵培养基（也可以初筛时一起准备），3~5瓶/株菌（100mL/瓶），灭菌。将摇瓶培养好的菌种，用2mL无菌吸管吸取2mL接种于100mL发酵培养基中（装于500mL三角瓶），37℃摇瓶培养（往复式110转/分钟）3天。3天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。根据结果可以判断所选菌株产酶能力是否稳定。本次实验基本流程准备发酵培养基灭菌冷却后接种环接种（1瓶/株）恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤测定酶活力确定1-2株复发酵菌株灭菌一级液体活化菌种液体菌种接种于发酵培养基（3-5瓶/株）准备发酵培养基恒温摇瓶培养发酵液棉花过滤测定酶活力思考题根据实验过程及结果，体会初筛和复筛的意义所在？根据已完成的实验，认真分析实验结果及所存在的问题？实验室中进行摇瓶发酵的一些问题介绍对微生物酶发酵研究中的一些问题进行讨论标准曲线制作的问题（配制所需测定物质的梯度浓度）酶的诱导问题（微生物长期适应进化的结果）酶发酵中氮源问题（蛋白质合成的一些问题）酶的合成中能量问题（需要消耗大量的能量）摇瓶发酵中的容量问题（三角瓶，250、500ml）发酵中的溶解氧问题缓冲液的配制问题在α-淀粉酶发酵培养基中CaCl2的使用问题在摇瓶发酵中非可溶性物质的加入问题化学分析中基准物的处理（纯度、结晶水的处理——不稳定）相关概念的介绍复壮——狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生长性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚在未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。相关概念的介绍菌种活化——使保藏的菌种（休眠状态）恢复到最佳生长状态（包括一些菌种性能的恢复），生长状态的均一化（相对）。一般包括：斜面活化（平板划线形成单菌落）；液体摇瓶培养；种子培养（针对大规模工业生产）。相关概念的介绍种子培养基：营养成分相对丰富，一般无限制性生长因子，有利于菌体的增殖，生长好；发酵培养基：营养成分有利于积累所需代谢产物，一般在培养基有一些限制性因子（包括培养条件）。注意：种子培养基接种于发酵培养基时，注意微生物生长延滞期（有一定营养成分重叠）。实验室摇瓶机（摇床）的作用使培养基一直保持均匀状态——菌体始终接触到新的营养成分（相对来说）；快速稀释代谢废物（一般对细胞有毒害作用，对人类来说可能有用）增加培养基中溶解氧的浓度，提高菌种的有氧代谢强度，加快物质的转化，有利于代谢产物的合成和积累。摇瓶机的种类旋转式——转速相应较高（200转以上），培养液贴壁旋转；往复式——转速不易太高，一般120转/分左右，培养液来回振荡，振荡液面较高；往复式的溶氧效果较好（相对旋转式）；注意摇瓶机的振幅（偏心距）。摇瓶发酵试验时三角瓶装量的要求一般要求装液量为三角瓶标注容量的1/10~1/5如500ml三角瓶经常加入50~100ml（常装50ml或100ml）；如250ml三角瓶经常加入25~50ml（常装50ml）；注意：根据需要可以特制（如加挡板，增加溶解氧）。菌种斜面菌种活化（18~24hr）液体摇瓶活化（18~24hr）接种摇瓶发酵培养（2%，48~72hr）液体菌种活化培养基

（种子培养基）可以利用微生物实验书的淀粉培养基，注意调节pH值；也可以利用发酵培养基（豆粕粉需要煮水后使用）。培养接种需发酵测定的菌种活化培养液，1mL/瓶（接种量2-5%，实验前后统一）。37℃，摇瓶振荡培养2-3天。实验α-淀粉酶活力测定方法介绍酶活力测定的方法碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位注意：去除β-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）α-淀粉酶酶活力测定的原理底物（反应物）为淀粉产物为麦芽糖、糊精等酶活力测定（碘比色法——目视）酶活力定义：在60℃下1小时内将1克淀粉转化为糊精的酶量称一个酶活力单位（5~10分钟反应完成）。淀粉及糊精检测原理：碘检测淀粉（紫蓝色，30分子以上）→红色糊精（红棕色，7-30分子）→无色糊精，7分子以下）→麦芽糖（不显色）→葡萄糖（不显色）计算公式：

酶活力测定步骤发酵液（酶液）2%淀粉液20mL+5mLpH6.0缓冲液预热5min（60℃）预热5min（60℃）吸取0.5mL混匀、计时（保温60℃），反应开始在白瓷板上定时取样（1滴）比色比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）代入公式计算酶活力单位1mL标准糊精液＋3mL标准稀碘液混匀标准比色管（红棕色）对照比色确定反应终点2min后未见明显变色（继续取样比色），但可以进行下一组测试。30min后未见明显变色，可以终止测试（结果意义不大）。所选菌株产α-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排（液体二级活化）上课前一天下午17：00~17：30将斜面菌种接种一环于5mL种子培养基中（装于18×180mL），37℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）14~16hr。上课当天上午8：00~8：30将上述摇瓶培养好的菌种，用1mL无菌吸管吸取1mL接种于30mL种子培养基中（装于250mL三角瓶），37℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）8~10hr。初筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表初筛菌株α-淀粉酶活力计算记录表班次：组号：姓名：菌株编号反应时间稀释倍数