牦牛弓形虫病诊断技术

1牦牛弓形虫病诊断技术本文件适用于牦牛弓形虫病的诊断、流行病学调查NY/T573-2022NY/T541-20163.1弓形虫Toxoplasmagondii腹泻、呼吸困难和中枢神经系统症状等，剖检以3.2牦牛弓形虫病yaktoxoplas4缩略语PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactioELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmuPBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSalin25.2初步判定无菌采集疑似患病动物（或死亡动物）的淋巴结穿刺液、血液、腹水或羊水等体液0.5mL~1mL或将采集样品在24h内送往实验室进行检测，采样应符合NY/T541-23附录B.3）、1%琼脂糖凝胶（见附录B.4）、Go以弓形虫529bp重复序列为靶基因（见附录C）。上游引物：5’-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’下游引物：5’-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3’根据全血/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明书，提取样品组织基因组DNA作为PCR反应的模9.1设备和器材9.2试剂和材料PBST洗涤液（见附录B.6）、封闭液（见附录B.7）、TMB显色液、终止9.3操作方法9.3.1样品处理4取无菌采集的牦牛血液约1mL，斜放于4℃静置5h后，置室温待血清析出，1000g离心10min分离9.3.2.1抗原包被9.3.2.2洗涤9.3.2.3封闭9.3.2.4待检血清洗涤3次。将待检血清用样品稀释液作1:20稀释后，每孔100μL，同时做阴性、阳性血清和空白对9.3.2.5酶标抗体9.3.2.7终止反应9.3.2.8读数9.3.3结果判定在阴性血清对照孔和空白对照孔OD<0.15、阳性血清对照孔OD≥0.4时，按如下条件进行结果判被检血清孔OD平均值≥0.2，且被检血清孔OD56取姬姆萨粉0.5g，甘油25mL混匀，60°C水浴加热2h，其间不断搅拌混匀。冷却至室温后加入甲醇NaCl8.5g，Na2HPO41.1g，NaH2），），7CTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTGTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTGTTTTTCTGATTTTTGACTCGGGCCCAGCTGCGTCTGTCGGGATGAGACCGCGGAGCCGAAGTGCGTTTTCTTTGACTTTTTTTTGTTTTTTCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTTGGAGCCACAGAAGGGACAGGAAGGGGACTACAGACGCGATGCCGCTCCTCCAGCCGTCTTGGAGGAGAGATATCAGGGATGAAGGCGAGGGTGAGGATGAGGGGGTGGCGTGGTTGGGAAGCGACGAGAGTCGGAGAAGAAGATGTTTCCGGCTTCCCTGCTTTTCCTGGAGGGTGGAAAAAGAGACACCGGAATGCAGACGAGACGACGCTTTCCTCGTGGTGATGGCGGAGAGAATTGAAGAGTGGAGAAGAGGGGAGACAGAGTCGGAGGCTTGGACGAAGGGAGGAGGAGGGGTAGGAGAGGAATCCAGA89PCR仪、高速冷冻离心机、细胞破碎仪、恒温摇床、核酸、蛋白电泳装置、紫外分光光度计、蛋白引物ExpSAG1-F/ExpSAG1-R（10μMBamHI和XhoI限制性内切酶，T4DNA连胶DNA回收试剂盒，克隆载体pETASYTM-T1，表达载体pET-28a，感受态大肠杆菌DH5α,感受态大肠His标签蛋白纯化试剂盒，LB培养基，一次性针头滤器（孔径0.45μm），蛋白浓缩管。SAG1ExpSAG1-FExpSAG1-R5’-CGgaattcTCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATC-3’5’-CCGctcgagTTAAGCCGATTTTGCTGACCCTG-3’EcoRIXhoIEcoRI、1μLXhoI，6μLddH2O，37℃酶切30~60min。E.5.1取阳性表达菌Transseta，按1:100的比例接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃180rpm/min振荡培养至菌液OD600为0.4~0.E.5.2将诱导培养的菌液分装到离心管中，在4℃下8000rpm离心10min，弃上清液。E.5.4将破碎菌体裂解物在4℃以1E.5.6将透析后的蛋白转入蛋白浓缩管，于4℃40浓缩管中蛋白浓度大于1mg/mL时停止离心。E.5.7浓缩的重组蛋白分装于1.5[1]Robert-GangneuxF,DardéML.Epidemiologyofanddiagnosticstrategiesfortoxoplasmosis[J].ClinMicrobiolRev,2012,25(2):264-9[2]HillD,DubeyJP.Toxoplasmagondii:transmission,diagnosisandprevention[J].ClinMicrobiolInfect,2002,8(10):634-640.[3]FilisettiD,GorciiM,Pernot-MarinoE,etal.Diagnosisofcongenitaltoxoplasmosis:comparisonoftargetsfordetectionofToxoplasmagondiibyPCR[J].JClinMicr