GB∕T 43286-2023 一次性采样管（灭活型）（正式版）

一次性采样管(灭活型)2023-11-27发布国家标准化管理委员会I Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 2 25.1组成 25.2采样管 25.3采样液 35.4技术要求及参数 36试验方法 46.1外观 46.2材质 46.3采样管密封性 46.4采样液装量 56.5灭活性能 66.6核酸稳定性 67检验规则 67.1出厂检验 67.2型式检验 6 78.1标签 78.2说明书 78.3包装 88.4运输 88.5贮存 8附录A(资料性)采样管示意图 9附录B(资料性)采样拭子示意图 附录C(规范性)采样液灭活性能试验方法 C.1方法原理 C.2试验条件 C.3材料与试剂 ⅡC.4仪器与耗材 C.5样本 C.6试验步骤 C.7结果判定 附录D(规范性)核酸稳定性试验方法 D.1试验条件 D.2试剂与仪器 D.3样本 D.4试验步骤 D.5结果计算 D.6结果判定 参考文献 ⅢGB/T43286—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生物样本标准化技术委员会(SAC/TC559)提出并归口。本文件起草单位：中国计量科学研究院、中国科学院微生物研究所、江苏康为世纪生物科技股份有限公司、友康生物科技(北京)股份有限公司、北京元码医学检验实验室有限公司、中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心、中国食品药品检定研究院。本文件主要起草人：王晶、杨利敏、李曼莉、殷剑锋、李海峰、朱以萍、纪鑫、傅博强、闫攀登、宋畅、对含病原微生物特别是病毒等的生物样本的有效采集，对于后期的核酸检测非常重要。一次性采样管(灭活型)是一种重要的采集生物样本的产品，对生物样本中病毒的有效灭活能够降低样本处理和检测过程中的生物安全风险；同时，采样管中生物样本所含核酸在一定时间内保持足够的稳定性和完整性能够提供满足核酸检测要求的生物样本。因此，为规范采样管产品，本文件对一次性采样管(灭活型)进行了标准化规范要求，目的是为生产企业和质量监管部门提供标准参考。IN1一次性采样管(灭活型)1范围注：采样管用于保存鼻拭子、咽拭子和环境拭子等采集的生物样本，并将生物样本中的病毒灭活，满足所采集生物样本中的病毒核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于GB/T191包装储运图示标志GB/T2828.1—2012计数抽样检验程序第1部分：按接收质量限(AQL)检索的逐批检验抽样计划GB/T9969工业产品使用说明书总则GB/T37875核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范GB41918—2022生物安全柜下列术语和定义适用于本文件。用于保存所采集生物样本的管具。采用一定的方法使生物样本中的微生物失去感染能力和复制能力。采样管(3.1)内用于保存生物样本的溶液。标示装量labeledvolume采样管(3.1)内的采样液充装的体积。由核苷酸或脱氧核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。2注：具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗产信息和传递遗传信息。包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类。脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid;DNA由四种主要的脱氧核苷酸(脱氧单磷酸腺嘌呤、脱氧单磷酸鸟嘌呤、脱氧单磷酸胞嘧啶和脱氧单磷酸胸腺嘧啶)通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的带有遗传信息的生物大分子。由核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的多聚体。注：核酸的一类。不同种类的RNA链长不同行使各式各样的生物功能，如与蛋白质生物合成有关的RNA有信使RNA(messengerRNA,mRNA)、转运RNA(transferRNA,tRNA)和核糖体RNA(ribosomneRNA,rRNA);与转录后加工有关的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoR-NAs);与生物调控有关的RNA有微RNA(microRNA,miRNA)、干扰小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。核酸稳定性nucleicacidsta在规定时间内，核酸未发生降解而保持完整性和可检测的状态。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct:循环阈值(cyclethreshold)DMEM:达尔伯克(氏)必需基本培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)NP-40:乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)PBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline)PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)TCID₀:半数细胞感染量(50%tissuecultureinfectiousdose)5要求采样管由管盖、管体、采样液和标签组成，具体结构见附录A。5.2.1.2采样管的形状应保证其能够直立放置，使用时不会倾倒；通常采用带裙边采样管，如底部圆锥形带裙边采样管、底部锥形带裙边采样管(见图A.1)。5.2.1.3采样管的形状宜能兼容自动化设备，方便后续检测使用。3采样管的管盖和管体应满足一定厚度，防止静态挤压与动态撞击时，管体变形或破碎。管体宜透明，便于观察采样液及采集的生物样本。5.2.2.2化学性能及耐辐射性能采样管材质应耐腐蚀、耐伽马射线辐照，在一80℃～—20℃的低温环境或121℃的高温环境下不发生破损、变形等损坏；宜选用符合YY/T0242要求的医疗级聚丙烯(PP)等树脂材料。5.2.3.1采样管的管盖应具有与管体相匹配的内旋或外旋螺口，并应配有密封圈，以保证管盖和管体严格密封，确保采样管的密封性。5.2.3.2采样管密封性应满足以下两种方法的试验要求：——重量分析法：采样管在模拟12h运输状态前后的两次质量差值不大于5mg;——真空负压法：在密封测试仪内，压力达到一90kPa后的3min内，采样管管帽周围无连续气泡产生，且采样管内部无试验用水渗入。5.3采样液5.3.2.1采样液对所保存的生物样本应具有病毒灭活特性和保持核酸稳定的特性，其中应至少含有蛋白变性剂(如异硫氰酸胍、盐酸胍等)、表面活性剂(如曲拉通X-100、脱氧胆酸盐、SDS、NP-40等)或催化剂等能使病毒失去感染能力和复制能力的成分；还可配有缓冲剂、平衡盐、蛋白酶K、聚乙二醇、金属离子螯合剂等其他成分；采样液中不宜使用肝素类等影响PCR检测的成分。5.3.2.2采样液的溶剂应使用电阻率不小于18MΩ的超纯水；不宜使用普通纯化水或蒸馏水。5.4技术要求及参数5.4.1标示装量5.4.1.1应根据采样管尺寸、采样拭子的拭子头长度和数量对应不同的采样液充装体积，即标示装量。5.4.1.2采样管内采样液的标示装量应与采样管尺寸、拭子头长度和数量相匹配。拭子头应全部浸没在采样液中，确定采样液的标示装量。不同尺寸采样管的标示装量与采样管尺寸、采样液液面高度和拭子头数量之间关系的基本要求应符合表1的规定；不同尺寸采样管示意图见图A.2。5.4.1.3采样管配套使用的采样拭子的拭子头长度应在20mm～28mm之间，拭子头部最大直径不大于5.5mm。采样时放入采样管中的拭子头数量超过5支时，应采用3cm断点的拭子；附录B给出了采样拭子的示意图。5.4.1.4采样管中采样液的实际充装量不应低于表1中规定的标示装量最低值。表1之外尺寸采样管中采样液的实际充装量应不低于产品声称的标示装量。4表1采样管内采样液标示装量的基本要求采样管尺寸(长度“×外径)mm×mm标示装量mL/管采样液液面高度”mm全部浸没采样液中的拭子头数量支(50±5)×(10士1)1.0±0.220.5士4.51(100±5)×(16±1)2.2±0.215.5±4.514.0±1.025.0士5.056.0士0.544.0士8.0(100士5)×(25±1)11.5±0.533.0±2.020°15.0±0.540.5士3.5(120±1)×(30±1)15.0±2.023.5±2.5长度为包括管盖在内的采样管的整体高度。’采样液液面高度的测量方法是从采样管底部锥形的上水平面到采样液液面的垂直高度，示意图见图A.3。拭子头部最大直径应小于4.0mm。5.4.2采样液的灭活性能采样管中的采样液应具备灭活性能，能彻底灭活样本中的病毒，使病毒丧失感染活性和复制能力。灭活性能应采用具有感染活性和复制能力的活病毒样本进行试验，以确定采样液的灭活性能。5.4.3核酸稳定性5.4.3.1采样管所采集的生物样本，其中的核酸物质应在采样液中于4℃的条件下保持稳定48h。5.4.3.2对于采用荧光定量PCR方法进行的核酸稳定性试验，Ct值变化率应不高于5%。6试验方法6.1外观在自然光下肉眼目测。6.2材质按照YY/T0242的方法对采样管材质的物理机械性能、化学性能及耐辐射性能进行试验。6.3采样管密封性天平：分度值为0.001g。摇床：转速不低于60r/min。计时器：计时范围0min～720min,最大允许误差不超过±0.5s/d。按照以下步骤进行试验：5a)用天平称量采样管的质量，记为质量M₁。b)将采样管倾斜置于摇床上，设置转速为60r/min,模拟运输状态。12h后取下采样管，称量采样管的质量，记为M₂。c)根据式(1)计算两次质量之差△M。△M=M₁-M₂……(1)式中：M₁——模拟运输前采样管的质量，单位为克(g);M₂——模拟运输12h后采样管的质量，单位为克(g)。密封测试仪：测量范围-90kPa～0kPa;精度1kPa。计时器：计时范围0min～5min,最大允许误差不超过±0.5s/d。蒸馏水或超纯水。通过对真空室抽真空，使用检验合格的密封测试仪对采样管的密封性进行试验。使浸在蒸馏水或超纯水中的采样管产生内外压差，观测采样管内气体外逸或水向内渗入情况，以此判定采样管的密封性能。步骤如下：a)向密封测试仪的真空室内注入适量蒸馏水，将采样管放入真空室内，浸入水中，采样管的顶端与水面距离不应低于25mm;b)盖上真空室的密封盖，将压力调节至一90kPa,待仪器内压力达到一90kPa后，打开密封测试仪开关，计时器计时3min;c)观察抽真空过程中和真空保持期间采样管的泄露情况。6.4采样液装量天平：分度值为0.001g。移液器：量程为1mL～10mL。烘箱：温度变化范围为25℃~100℃。按照以下步骤进行试验：a)使用密度测试仪测量采样液的密度，记为p;b)用天平称量装有采样液的采样管的质量，记为m₁;c)使用移液器取出采样管内的采样液并烘干，用天平称取烘干后恒重的采样管的质量，记为m₂;d)根据式(2)和式(3)计算体积误差△V;6GB/T43286—2023式中：V₁——采样液的实际体积，单位为毫升(mL);m₁——装有采样液的采样管的质量，单位为克(g);mz——去除采样液烘干后恒重的采样管的质量，单位为克(g);p——采样液的密度，单位为克每立方厘米(g/cm³);式中：△V——采样液标示装量的误差；V₂——采样液标注的体积，单位为毫升(mL);V₁——采样液实际的体积，单位为毫升(mL)。6.5灭活性能按照附录C对采样管内的采样液进行病毒灭活性能试验。6.6核酸稳定性按照附录D规定的方法进行核酸稳定性试验。7检验规则7.1出厂检验7.1.1出厂的每一件产品均应检验采样管外观。7.1.2出厂前应对采样管产品的密封性、标示装量和生物样本核酸稳定性项目进行抽样检验。抽取样本量按照GB/T2828.1—2012的规定执行，留存样本量与抽取样本量一致。7.1.3判定规则：出厂检验采样管产品的外观结果不合格，判定该件产品不合格；出厂检验采样管产品的密封性、标示装量和核酸稳定性项目结果中有一个项目不合格，则判定该批次产品不合格；不合格产品均不应出厂。7.2型式检验7.2.1型式检验项目为第5章要求中规定的所有项目。采样管材质和采样液成分的来源应提供有效证明材料7.2.2型式检验每半年或每年应进行一次。当出现但不限于下列情况之一时应当进行型式检验：a)新产品或者产品转厂生产的试制鉴定时；b)产品原料来源或生产工艺有较大变化，使产品质量和性能可能受到影响时；c)停产后恢复生产时；d)出厂检验结果与上次型式检验结果有较大差异时；e)国家有关质量监督部门提出型式检验要求的情况时；f)用户提出进行型式检验的要求时。7.2.3抽取样本量按照GB/T2828.1—2012的规定执行，留存样本量与抽取样本量一致。7.2.4判定规则：有任何一个项目不符合第5章的要求，则判断该件产品不合格。型式检验结果按照GB/T2828.1—2012接收质量限(AQL)0.01进行判定。78.1标签8.1.1.1采样管标签标注的信息应字体清晰、内容完整。8.1.1.2采样管所用标签标注的信息应包括但不限于以下内容：b)生产企业名称；c)生产日期，或批(编)号；d)唯一标识，或用户自备条码；e)有效期限；f)贮存条件；g)警示标识。8.1.2.1采样管上的标签应不透明，大小不应完全包围管体。8.1.2.2采样管上的标签应在其有效期内保持附着，不脱落。8.1.2.3采样管上的标签应耐高温、耐低温、可防潮，防止标签信息褪色或脱落丢失。8.1.2.4采样管上的标签应耐酒精、含氯消毒剂等有机溶剂，标签信息经酒精、含氯消毒剂等有机溶剂消毒后不褪色。8.2说明书8.2.1采样管每个最小销售单元均应附有说明书。8.2.2说明书的编制应符合GB/T9969的规定。8.2.3采样管说明书应使用不小于6号的字体，中文字体宜为宋体，全文字体格式应统一并易于识别。8.2.4说明书宜包含以下内容：b)采样液的成分组成；c)采样液的标示装量；d)采样液的保存稳定性、灭活性能；f)生产日期、有效期限或失效日期；h)使用注意事项；i)相关标识符号和图形的说明；j)采样管使用后的安全处置；k)生产企业和/或注册人的名称、地址、联系方式；1)售后服务的联系方式；m)生产许可证号、产品准入的凭证号和技术要求编号；n)说明书的编制日期和修订日期。88.3.1单支采样管的包装是提供使用的最小包装。8.3.2最小销售单元包装内应附有说明书、质量合格标识或产品合格证。8.3.3包装及封口标签无破损，包装标签的字迹在有效期内应清晰。8.3.4最小销售单元包装内可选择配置具有生物安全标识的自封袋。8.4.1在运输过程中避免阳光暴晒、重压、抛掷、雨淋、剧烈震动与撞击。运输包装件基本试验见GB/T4857(所有部分)。8.4.2应保持包装完好无损，包装箱应按照箭头标志堆放，不倒置。8.4.3产品包装储运图示标志应符合GB/T191的规定。8.5贮存产品应贮存在阴凉、干燥的库房内；不应与有毒、易燃、易爆物品同时贮存。贮存环境条件应满足说明书的要求。9GB/T43286—2023(资料性)采样管示意图采样管示意图见图A.1,不同尺寸的采样管示意图见图A.2,采样管内采样液液面高度示意图见图A.3。a)带裙边采样管b)底部锥形采样管c)底部圆锥形采样管标引序号说明：1——管盖；2——管体；3——标签；4——采样液；5——裙边。a锥体上水平面高于裙边。b锥体上水平面与裙边齐平。图A.1采样管示意图a)(50±5)mm×(10±1)mm尺寸采样管示意图b)(100±5)mm×(16±1)mm尺寸采样管示意图c)(100±5)mm×(25±1)mm尺寸采样管示意图d)(120±1)mm×(30±1)mm尺寸采样管示意图图A.2不同尺寸的采样管示意图a)锥底高于裙边类采样管液面高度示意图b)锥底与裙边齐平类采样管液面高度示意图标引序号说明：1——液面高度；2——液面高度。图A.3采样管内采样液液面高度示意图GB/T43286—2023(资料性)采样拭子示意图为便于理解表1中涉及的采样试子的断点，采样拭子的组成示意图见图B.1,采样拭子由拭子杆和拭子头组成，含断点。3cm断点是本文件中所提到的采样过程中放入采样管中的采样拭子数量大于5支时，宜采用的断点。标引序号说明：1——拭子头；2——拭子杆；3——3cm断点。图B.1采样拭子的组成示意图(规范性)采样液灭活性能试验方法C.1方法原理本方法将病毒样本加入采样管，通过采样液中的灭活剂成分灭活样本中的病毒，然后用超滤法去除对细胞有毒性的灭活剂成分，再用经灭活处理的病毒样本接种细胞盲传三代，每代细胞连续3d观察细胞病变，并取样进行TCID₅测定、噬斑试验或HIV-1病毒抗原p24试验，依据结果判定病毒是否被彻底灭活。对于囊膜病毒样本的灭活性能测定，采用甲型流感病毒标准毒株(WSN)或者人免疫缺陷病毒(HIV)作为试验样本；对于非囊膜病毒的灭活性能测定，采用肠道病毒71型或脊髓灰质炎病毒作为试验样本。C.2试验条件警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。流行性感冒病毒A/WS/33灭活性能检测的试验操作应在生物安全一级实验室(分子生物学实验室)中进行；肠道病毒71型和脊髓灰质炎病毒I型疫苗株病毒灭活性能检测的试验操作应在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行；人免疫缺陷病毒灭活性能检测的试验操作应在生物安全三级实验室的生物安全柜中进行。实验室环境温度宜在15℃~30℃,相对湿度≤85%。C.3材料与试剂警示——本文件使用的试验材料采取适当的贮存方式，并保证符合国家有关法规规定的条件。可选择使用以下试验材料：a)流行性感冒病毒A/WS/33(ATCCVR-825);b)肠道病毒71型(ATCCVR-1432);c)脊髓灰质炎病毒I型，疫苗株(ATCCVR-1562);d)人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)感染性克隆(pNL4-3,NIH编号AF324493);e)非洲绿猴肾传代细胞(VERO,ATCCCCL-81);f)犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL-34);g)TZM-bl细胞(又称JC53BL-13,NIHAIDS试剂库：8129)。应使用以下试验试剂：a)采样液；b)生理盐水；c)消化液：含0.03%乙二胺四乙酸及0.25%胰蛋白酶的PBS溶液或类似消化液；d)DMEM细胞培养基(高糖):含L-谷氨酸和丙酮酸钠；e)无血清DMEM培养液：含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；h)2×无酚红DMEM细胞维持液：含4%胎牛血清、200U/mL青霉素和200μg/mL链霉素；i)无酚红DMEM细胞培养基；j)PBS配制的2%低熔点琼脂；k)4%多聚甲醛溶液；1)结晶紫：以20%乙醇(体积比)配制成1%的溶液，4℃避光保存，临用前与双蒸水(ddH₂O)按照1:1稀释使用；m)配制1mg/mL甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮处理的胰酶(TPCK-Trypsin)储存液；n)1×PBS缓冲液(不含钙镁离子):pH7.4;o)人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)(应具有国药批准号)。C.4仪器与耗材应准备以下仪器：a)离心机；b)CO₂培养箱；c)倒置显微镜；f)水浴锅；g)酶标仪，检测波长450nm;C.4.2耗材应准备以下耗材：b)超滤管(截留分子量为100kDa);c)12孔平底细胞培养板；d)96孔平底细胞培养板；e)细胞培养瓶；g)无菌离心管及管架；C.5样本警示——处理含病毒材料时，应使用部分或全部排风的Ⅱ级生物安全柜，所使用的生物安全柜应经过一年一度的常规检测(按照GB41918—2022的要求);每次试验前后应对实验室及生物安全柜内各进行1h紫外灯照射处理，物体表面需使用1000mg/L含氯消毒液进行消杀，试验产生的废弃物应经GB/T43286—2023过高温高压灭菌后按照医疗废弃物进行处理。试验开始前应清除试验区域内无关物品，防止对试验或生物安全柜的气流造成干扰。手套、面屏等。个人防护用品应符合国家规定的有关技术标准。按照相应的防护级别，使用适当的个人防护装备。C.5.1灭活病毒样本制备将保存的甲型流感病毒、肠道病毒71型、人免疫缺陷病毒I型感染性克隆或脊髓灰质炎病毒工型疫苗株按照表C.1的操作方法添加至采样管中，设立试验组、阳性对照组和阴性对照组，置室温放置表C.1灭活病毒样本制备方法组别操作方法试验组1mL病毒(10°TCIDso/mL～10²TCIDso/mL)加入到含3mL采样液的灭活采样管中阳性对照组1mL病毒(10⁶TCIDo/mL～107TCID/mL)加入到3mL生理盐水中(体积与采样液一致)阴性对照组1mL生理盐水加入到灭活采样管中C.5.2去除灭活成分(超滤法)按照以下步骤进行：a)将采样液用0.22μm滤器进行除菌过滤处理；b)将按照C.5.1要求制备的0.5mL含病毒采样液加入到截留分子量为100kDa的超滤管中；c)添加4.5mL的生理盐水，在4℃、3000g离心超滤，至超滤管内上层液体体积约为0.5mL时停止离心；d)再次加入4.5mL的生理盐水，4℃,3000g离心超滤，重复5次；e)加入0.5mL无血清DMEM培养基混匀；f)阳性对照组和阴性对照组按照a)～e)的方法进行操作。C.5.3病毒灭活验证C.5.3.1准备工作染毒前一天T75培养瓶中的MDCK、Vero细胞或TZM-bl细胞进行1:4传代，调整细胞浓度，在12孔板每孔加入1×10⁵细胞铺板，置CO。孵箱培养至单层细胞。C.5.3.2样本接种细胞按照以下步骤进行：a)弃去细胞培养液，用PBS缓冲液清洗细胞1次；b)取100μL已去除灭活成分的灭活病毒液，与无血清DMEM培养液按照1:2的比例稀释，将300μL病毒稀释液感染12孔板的1个细胞孔，补加无血清DMEM培养液至1mL(感染流感病毒时感染液中TPCK-Trypsin终浓度为1μg/mL);c)按照b)操作，共处理3个复孔，37℃、5%CO₂条件下孵育1h,弃去孔中液体后，补加1mL含2%血清的DMEM维持液，继续培养72h;d)取培养基上清，4℃、3000r/min离心5min,收集上清，标记为第一代。C.5.3.2.2第二代和第三代感染按照以下步骤进行：a)分别从3个一代病毒液中取300μL感染12孔板的1个细胞孔，补加无血清DMEM培养液至1mL(感染流感病毒时感染液中TPCK-Trypsin终浓度为1μg/mL);b)置于37℃、5%CO₂条件下孵育1h,弃去孔中液体，补加1mL含2%血清的DMEM维持液，对于TZM-bl细胞，则需补加1mL含10%血清的DMEM维持液，继续培养72h;c)取培养基上清，4℃、3000r/min离心5min,收集上清，标记为第二代；d)重复二代操作，收获第三代病毒液。C.6.1细胞病变观察每代病毒培养时，在倒置显微镜下观察Vero细胞或MDCK细胞的病变情况。观察细胞圆缩、脱落、细胞膜边缘不整齐、胞浆中出现颗粒样凋亡小体，以及病毒合胞体的形成等现象，并记录。C.6.2.1取每代病毒培养液，按照以下步骤进行TCID测定：a)用无血清DMEM培养基(感染流感病毒时稀释液中TPCK-Trypsin终浓度为1μg/mL)对待滴定病毒样本做10倍梯度稀释；b)将稀释后的病毒液加入已铺有细胞的96孔培养板中，每孔加100μL,每个稀释度8个重复，在37℃条件下，放置1h～2h,以确保病毒吸附在细胞上，同时设立阴性对照(NC);c)取出培养板，用无血清DMEM培养液清洗细胞2次～3次，更换为DMEM维持液；d)放入CO₂培养箱中(37℃,5%CO₂)培养，每隔12h在显微镜下观察细胞病变，连续观察3d,逐孔观察并记录细胞病变情况。C.6.2.2终点稀释法病毒感染滴度计算用TCID₅表示，根据Reed-Muench氏法计算。例如，当统计细胞病变情况如表C.2所示时，按照Reed-Muench氏法计算TCID如表C.3所示。相应距离比=(高于50%的病变百分数一50)/(高于50%的病变百分数一低于50%的病变百分数)=0.5;1gTCID。=高于50%感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数=6.5;TCID=10^5/100μL。表C.2细胞病变统计情况示意图表重复试验编号A十十十十十十—— —B十十+十十十一一 一 C十十十十十十—一一—D十十+十十十—一—一E十十+十十十一一—一—表C.2细胞病变统计情况示意图表(续)编号NCF+十十十十十一一一—一G十十十十十十—一 ——H十十十十十十—一 — 表C.3各病毒浓度下的细胞感染比例情况列表稀释倍数病变数未病变数累计比率病变良好合计80080080080080080808080880080008000800C.6.3噬斑试验取每代培养病毒液，按照以下步骤进行噬斑试验：a)用无血清DMEM培养液(感染流感病毒时稀释液中TPCK-Trypsin终浓度为1μg/mL)对待滴定病毒做10倍梯度稀释；b)以1×10⁵细胞接种12孔板，置于CO₂培养箱过夜，使细胞长成单层，待单层细胞汇合度达到90%后，将培养孔中培养液倾出；c)加入1mL不同梯度稀释病毒溶液，置于37℃孵育1h;d)吸弃病毒液，用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，去除残余液体；e)将加热融化的2%低熔点琼脂冷却至50℃时，与37℃预热的2×无酚红DMEM细胞维持液等体积混合，迅速加入到细胞培养孔中，每孔加入1mL;f)将培养板4℃冷却10min,待琼脂凝固后置于37℃细胞培养箱中倒置培养48h～72h;g)试验终点后，向每个孔中加入1mL4%多聚甲醛溶液固定30min,用自来水冲洗后加结晶紫染色20min,冲洗干净后计数，细胞孔内圆形不着色的透明区即为一个噬斑单位。采用人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒进行HIV-1病毒抗原p24的试验，具体操作按照所选择的试剂盒说明书进行。C.7结果判定C.7.1根据所选择的试验对象和试验方案，依据试验结果，进行灭活性能的结果判定。C.7.2当试验结果同时满足以下a)和b),或者a)和c),或者a)和d)时，可判定病毒被彻底灭活。a)阳性对照组的每代病毒培养物在显微镜下观察到细胞病变；阴性对照组的每代病毒培养物在显微镜下未观察到细胞病变；试验组与阴性对照组一致。针对HIV-1病毒，阳性对照组的每代病毒培养物中观察到病毒合胞体；阴性对照组的每代病毒培养物中未观察到病毒合胞体；试验组与阴性对照组一致。b)阳性对照组的每代病毒液TCID测定值大于10°87TCID₀/mL;阴性对照组的每代病毒液TCID₅₀测定值小于10°87TCIDs/mL;试验组与阴性对照组一致。c)阳性对照组的每代病毒液空斑滴定在10-1滴度时有明确空斑形成；阴性对照组的每代病毒液空斑滴定在10-1滴度时未见明确空斑形成；试验组与阴性对照组一致。d)针对HIV-1病毒，阳性对照组的每代病毒液HIV病毒抗原p24的试验结果为阳性；阴性对照组的每代病毒液HIV病毒抗原p24的试验结果为阴性；试验组与阴性对照组一致。(规范性)核酸稳定性试验方法D.1试验条件警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。采用DNA、RNA病毒核酸标准物质或质控品进行核酸稳定性检测的试验操作时，应在不低于生物安全一级实验室(分子生物学实验室)中进行；在进行流行性感冒病毒A/WS/33的灭活、核酸提取和稳定性检测的试验操作时，应在不低于生物安全一级实验室中进行。实验室环境温度宜在15℃~30℃,相对湿度≤85%。D.2试剂与仪器D.2.1材料应准备以下材料：a)RNA核酸标准物质，如新型冠状病毒核酸标准物质、新型冠状病毒核酸基体标准物质；b)DNA核酸标准物质，如乙肝病毒核酸标准物质、非洲猪瘟病毒核酸标准物质或核酸质控品；c)病毒，如流行性感冒病毒A/WS/33(ATCCVR-825)。D.2.2试剂应准备以下试剂：a)符合GB/T37875要求的核酸提取试剂盒；b)荧光定量PCR试剂盒，检出限不高于500copies/mL。D.2.3仪器荧光定量PCR仪。警示——当处理病毒材料时，应使用部分或全部排风的Ⅱ级生物安全柜，所使用的生物安全柜需经过一年一度的常规检测(按照GB41918—2022的要求);每次试验前后需对实验室及生物安全柜内各进行1h紫外灯照射处理，物体表面需使用1000mg/L含氯消毒液进行消杀，试验产生的废弃物应经过高温高压灭菌后按照医疗废弃物进行处理。试验开始前清除试验区域内无关物品，防止对试验或生物安全柜的气流造成干扰。人防护用品应符合国家规定的有关技术标准。按照相应的防护级别，使用适当的个人防护装备。D.3.1样本处理应按照以下步骤处理病毒材料：a)将标定浓度≥107copies/mL的已热灭活的病毒(如流感病毒)用无菌磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行梯度稀释，制备成不同浓度梯度的病毒样本；b)分别取100μL样本溶液，添加至采样管中(1:3稀释);c)混合均匀，制备成终浓度分别为(1×10⁴~1×10⁵)copies/mL和(5×10²~1×10³)copies/mL的两种样本。D.3.2核酸标准物质D.3.2.1RNA核酸标准物质处理用无RNA酶水对RNA病毒核酸标准物质进行梯度稀释，制备成不同浓度梯度的新型冠状病毒核样本溶液，添加至采样管中(1:3稀释),混合均匀，制备成终浓度分别为1×10*copies/mL～1×10⁵copies/mL和5×10²copies/mL～1×10³copies/mL的两种样本。D.3.2.2DNA核酸标准物质处理用无DNA酶水对DNA病毒核酸标准物质或质控品进行梯度稀释，制备成不同浓度梯度的核酸样样本溶液，添加至采样管中(1:3稀释),混合均匀，制备成终浓度分别为1×10'copies/mL～1×10⁵copies/mL和5×10²copies/mL～1×10³copies/mL的两种样本。D.3.3样本保存处理将样本分成两组，一组立即进行病毒核酸的提取，另一组在4℃放置48h后进行病毒核酸的提取。每种浓度下每组设置3个复管。D.4试验步骤D.4.1核酸提取使用核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取步骤参照核酸提取试剂盒说明书的要求。D.4.2.2也可采用以下引物探针自行配制体系进行荧光定量PCR的检测，引物设计按照表D.1的要求。D.4.2.3建立荧光定量PCR反应体系。RNA病毒(如新型冠状病毒、流行性感冒病毒)的荧光定量PCR反应体系应按照表D.2进行；DNA病毒(如非洲猪瘟病毒)的荧光定量PCR反应体系应按照表D.3进行。D.4.2.4荧光定量PCR条件按照表D.4(适用于RNA病毒)或表D.5(适用于DNA病毒)的反应条件进行设置。引物和探针序列(5'→3')工作浓度新型冠状病毒“N-FN-RN-PROX-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA