驴驹大肠杆菌病防治技术规程-地方标准编制说明

1《驴驹大肠杆菌病防治技术规程》编制说明一、工作简况（一）任务来源本标准根据山东省市场监督管理局2020年下达的《全省标准化创新发展项目计划的通知》立项，鲁市监标函[2020]249号文件。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。承担此项地方标准制定的团队成员均为从事驴等大动物疫病防控的权威科研人员和基层从业人员，对全省规模化驴场的疫病情况比较熟悉。同时，也积累了可靠的数据和具有实际应用价值的技术经验，为此标准的制定奠定了基础。（二）起草单位、起草人及任务分工（1）起草单位聊城大学、聊城市东昌府区农业农村局、山东省滨州畜牧兽医研究院、中国农业科学院兰州兽医研究所、阳信县畜牧兽医管理服务中心、青岛农业大学、聊城市农业综合执法支队、山东畜牧兽医职业学院、北京美莱博医学科技有限公司、山东灼华生物技术有限公司、东阿阿胶股份有限公司、聊城职业技术学院和禹城惠民农业科技有限公司等单位协作完成。2（2）起草人及任务分工刘文强：聊城大学，主持标准制定，负责汇总撰写本标准所有技术内容。李亮亮、赵霞、秦绪岭、王长法、王彤彤、李在建、刘桂芹、周苗苗：聊城大学，负责汇总近几年驴场疫病。参与收集驴场的疫病情况。肖跃强：山东省滨州畜牧兽医研究院，提供驴驹大肠杆菌病防治方案。李维克：中国农业科学院兰州兽医研究所，提供驴驹大肠杆菌病诊断方案。何飞、张翠翠、谭鹏飞：聊城市农业综合执法支队，参与标准制定，参与收集驴驹腹泻疾病情况。董建宝：山东畜牧兽医职业学院，参与提供驴驹大肠杆菌病诊断方案。李洪波：北京美莱博医学科技有限公司，参与标准制定。任慧英：青岛农业大学，提供驴驹大肠杆菌病诊断方案。王玉燕：阳信县畜牧兽医管理服务中心，参与收集驴驹腹泻疾病情况。李启蒙：山东灼华生物技术有限公司，提供驴驹大肠杆菌病诊断方案。赵登福：聊城职业技术学院，参与收集驴驹腹泻疾病情3尹桂军、杨涛、姜桂苗：东阿阿胶股份有限公司，参与验证驴驹大肠杆菌病诊断和治疗。贾涛、邢世帅：禹城惠民农业科技有限公司，参与验证驴驹大肠杆菌病诊断和治疗。（三）起草过程2021年1月-12月，聊城大学、聊城市畜牧兽医主管部门和东阿阿胶股份有限公司等单位联合开展了规模化驴场主要疫病的诊断、治疗与预防攻关项目。承担此项标准制定的团队，根据规模化驴场驴驹大肠杆菌病发生的实际情况，按照预防为主、生物安全优先的原则，总结和借鉴了国内外禽、牛、猪、羊等相关畜种规模化养殖场大肠杆菌病防治的技术规程和研究成果，并充分考虑了饲养管理、疾病发生特点，完成了标准制定和论证等工作。同时，该团队对全国驴产业发展及驴场情况非常熟悉，也积累了可靠的数据和具有实际应用价值的技术经验，为此项地方标准的制定奠定了基2022年1月~2022年8月，根据任务要求，拟定工作计划，根据成员专业背景，分解任务。通过实地走访近100家规模化养驴场，召开不同规模的座谈会，开展不同形式的调查研究工作，掌握了大量的一手资料。起草小组实施了标准的编写工作，制定了编写方案。起草人员认真查阅了标准制定的有关文件，通过参加标准宣贯培训，对标准的格式、内4容、术语表达等进行了深入学习，严格遵循GB/T1.1-2020《标准化工作导则》所规定的标准化文件的结构和起草规则起草了《驴驹大肠杆菌病防治规程》。2022年9月~2023年7月，起草组以函审的方式广泛征求来自东北农业大学，哈尔滨兽医研究所，山东畜牧总站，山西农业大学，山东省农业科学院畜牧兽医研究所，新疆畜牧科学院畜牧研究所等高校科研院所的专家和阳谷荣发牧业，高唐县阿多宝畜禽养殖专业合作社等有关企业技术人员的意见，先后发出30条，回函的单位或专家数为22个，通过意见反馈，进行对标准内容和编制说明进一步修改和完善，形成送审稿。2023年7月~2023年9月，进行企业回归验证；9月7日在省畜牧局在济南召开了山东省地方标准组织专家审查会议，省市场监督管理局对审查会进行监督指导，来自山东师范大学、山东省动物疾病与控制中心等单位的9名专家提出标准内容删减，格式修改等意见，起草小组根据审查意见对标准文本进行修改完善，审查委员会对修改内容确认无误，最终形成报批稿。二、地方标准制定目的和意义我国是世界主要繁育驴的国家之一，拥有4000多年的养驴历史，而且我国驴的种质资源丰富，存栏数量曾一度长期居于世界首位。驴产业是我国重要的区域特色畜牧业，也是“精准扶贫”事业的重点产业。近年来，全国大力发展规模5化养驴，在政府主导，龙头企业带动下，驴产业迅速发展，肉用和药用产品的加工工艺进步显著，驴产品消费者逐年增多，市场开发前景十分广阔。在传统的养殖模式下，驴发生传染病的机会较少。与之相反，在规模化驴场，传染病频发造成群体感染的风险日益增加。驴的繁殖周期较长，一般为360天，且为单胎。因而驴驹的成活率对规模化驴场的经济收益至关重要，在驴场常见传染病中，由某些致病性或条件致病性大肠杆菌（pathogenicEscherichiacoli）引起的驴腹泻病是规模驴场最常见的一种疾病，也是影响驴驹健康的主要因素之一。起草单位对49个场进行幼龄驴驹腹泻病调查，其中33个规模驴场有腹泻病发生，场发病率为67.3%（33/49共调查4755头驴驹，其中1099头驴驹发病，发病率为23.1%（1099/4755其中高发日龄为15~45d。约有15%的病例在发病48h~72大肠杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，宿主范围广泛，分为共生菌和致病菌。致病性大肠杆菌是腹泻、食源性疾病和各种肠道外感染的主要病原。研究发现致病性大肠杆菌感染驴驹后主要表现为腹泻、败血症等特征，病死率高，对驴规模化养殖造成了严重的经济损失，而且临床上尚无可用的有效疫苗，常用治疗方法使用抗生素配合支持疗法治疗该病，但是由于驴驹免疫系统和消化器官发育不成熟及其抵抗力差，加之病原体毒力强，治疗结果收效甚微。同时盲目添加使用6或过量使用抗生素，导致耐药菌株越来越多，治疗效果越来越差，养殖效益越来越低，最终造成严重的经济损失；不仅如此，抗生素过量使用不但对驴源食品造成安全隐患，而且严重威胁人体健康。因此，有必要对规模化驴场驴驹大肠杆菌病防治进行规范，用于指导规模化驴场的驴驹大肠杆菌病的防治工作。因此，基于养殖场生物安全规范和预防为主的原则，制定驴驹大肠杆菌病的防治技术规程。本文件规定了驴驹大肠杆菌病的流行病学、临床症状、病理变化、诊断、预防、治疗的指导方针，还包括病死驴及病害驴处理和档案管理。本标准实施可有效解决目前规模化驴场面临的驴驹肠炎和败血症死亡率高、种驴携带并垂直传播大肠杆菌等问题。本标准的执行将有助于提高养驴企业对该病的综合防治水平。本标准在制定过程中，总结和借鉴了国内外禽、牛、猪、羊等相关畜种规模化养殖场防疫工作的技术规程和研究成果，并充分考虑了驴品种、饲养管理、疾病发生特点，为建设驴无规定疫病区和生物安全隔离区提供理论支撑，保障驴产业的健康发展。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准编制原则本文件参照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草：7（1）科学性：本标准所涉及的主要内容以我国多年在驴产业研究方面正式发表的研究成果和驴产业发展水平的现实情况为主，尤其是标准主要起草单位多年试验研究数据库，适当参考国外有关研究资料，对规模化驴场驴驹大肠杆菌病防治技术各环节进行全面评价。（2）协调性：将规模化驴驹大肠杆菌病防控分为驴驹大肠杆菌病诊断、大肠杆菌分离鉴定、大肠杆菌病防控等方面进行把关，前后连贯。（3）适用性：标准规定操作详实、可靠，实用性强，符合当前我国驴产业发展的实际，并适当超前具有引领性。（4）一致性：编制成员广泛查找资料，走访山东、陕西、新疆、内蒙古、辽宁等省或自治区内规模化驴养殖场（户），充分考虑我国驴养殖的生产实践，力求达到内容符合实际、可操作性强，确保本标准内容丰富、具体、易操作，并且实用性强。标准制定后能够广泛地适用于规模化驴场驴驹大肠杆菌病防控。（5）规范性：本标准的编写按照GB/T1.1标准化工作导则的第一部分：标准的结构和编写规则进行。本标准的编写按照GB/T1.1标准化工作导则的第一部分：标准的结构和编写规则进行。（二）主要技术内容1本标准涉及的专业术语和定义8驴驹大肠杆菌病（Donkeyfoalcolibacillosis）：由O78、O101、O8等特定血清型的致病性大肠杆菌引起驴驹的急性、接触性传染病。其病例特征呈现剧烈的下痢和败血症症状。本病常引起驴驹死亡，广泛发生于饲养管理不符合卫生要求的规模化驴场。2流行病学项目组研究发现，细菌性病原导致的腹泻在驴养殖场普遍发生，主要致病菌是大肠杆菌。对49个规模驴场4755头驴驹进行腹泻调查，场发病率为67.3%（33/49）；驴驹个体发病率为23.1%（1099/4755其中高发日龄为15~45d，约15%的病例在48~72h内死亡。因仅是引起肠炎和败血症的主要病原，也是引起驴驹严重腹泻、肺炎，造成驴驹大量死亡的病因，病死率为15%～20%。2.1病原特点驴驹大肠杆菌病的病原为肠杆菌科大肠埃希氏菌属中O788等主要血清型的致病性大肠杆菌。本病原菌为革兰氏阴性小杆菌，本菌存在于驴驹肠道及其粪便污染的环境中。2.2传染源发病驴驹和携带致病性大肠杆菌的驴。2.3传播途径起草单位在聊城市规模驴场腹泻病料中分离到416株大肠杆菌，经纯化培养、电镜分析，全自动生化鉴定，动物9感染试验和16SrRNA测序，共鉴定出85株致病性大肠杆菌。表明该病主要通过消化道传播，粪-口传播是主要途径。任何病原菌污染的东西都能传播，如粪便、污染的圈舍、饲料、水槽及饮水等。另外还能通过脐带或分娩时经产道传播。2.4易感动物8月龄内的驴驹均可发病，驴驹多于出生后2d~3d发病。在2015~2017年期间开展了腹泻驴年龄分布情况调查。把每个驴场内所有驴按年龄分为三个阶段，包括幼龄驴驹（0~~每个阶段随机选取100头驴并对腹泻现象进行统计记录，最后分析出腹泻情况严重的年龄段。调查结果显示：幼龄驴驹发病率约为31.8%，发病率最高，且死亡率高为12.4%；青年驴发病率为13.4%，发病率也较高，而死亡率高为3.7%。18月龄以上的驴发病率较低，多为经过性发病，无死亡率。2.5发病特点一年四季均可发生，以冬末初春季节交替时段多发，潜伏期为1d~2d。该病发病率通常为5%~40%，病死率为2%~20%。3临床症状驴驹发病初期体温升高，精神沉郁，食欲不振，粪便粥样或水样，剧烈腹泻，肛门失禁，排出液状粪便，呈黄色、白色或灰白色，有时含多量黏液或血液，腥臭味。发病中期出现衰弱，脱水，喜躺卧，无法站立。发病末期，食欲废绝，腹泻和便秘交替发生，由败血症和全身微循环衰竭致死。4病理变化对腹泻发病驴进行临床诊断发现，腹泻驴驹具有精神沉郁、厌食，发生带黏膜性黄色腹泻、水样腹泻、奶样腹泻以及带血样腹泻等不同类型腹泻、脱水严重不能站立等症状；剖检后，肝脏发暗色、脾脏出血、小肠粘膜脱落、败血症、盲肠粘膜脱落、直肠粘膜脱落、胃粘膜脱落并有草料不能排出等症状；采集发病驴的肠道，制做病理切片观察发现有十二直肠粘膜脱落、水肿、盲肠粘膜脱落、有大量单核细胞出现等症状。总结其病理变化为：胃黏膜脱落，有出血点和出血斑。小肠、盲肠和结肠表现为黏膜脱落。肝脏肿大、淤血。脾肿大，包膜下有出血点。心内膜和外膜也有出血点，肠系膜淋巴结肿大、出血。5.1临床诊断驴驹出现腹泻或败血症等症状可假定大肠杆菌感染，根据该病流行病学、临床症状和病理变化等做出初步临床诊5.2实验室诊断5.2.1采样按NY/T514的规定执行，主要采集肛拭子、腹泻物等病料。5.2.2细菌分离培养无菌取病料，经三区划线接种于麦康凯培养基上，37℃温箱培养24h，培养出表面光滑、粉红色圆形菌落。挑取符合大肠杆菌特征的单菌落纯化3次~4次。图1麦康凯培养基上的大肠杆菌菌落5.2.3显微镜检将单菌落革兰氏染色，镜检，油镜下（100×)呈现两端钝圆，单在或成对的革兰氏阴性菌，见图2。图2革兰氏染色镜检（100×)5.2.4生化鉴定将纯化后的细菌接种于葡萄糖、甘露醇、乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖、吲哚试验、V-P试验、甲基红试验、枸橼酸盐试验管37℃恒温培养24h后观察。结果显示：葡萄糖产酸产气、甘露醇产酸产气、乳糖产酸产气、麦芽糖产酸产气、吲哚试验和甲基红试验呈阳性，阿拉伯糖、V-P试验和枸橼酸盐试验呈阴性。见表1。表1大肠杆菌生化鉴定结果项目葡萄糖甘露醇乳糖阿拉伯糖麦芽糖吲哚试验+++-++-+枸橼酸盐-5.2.5大肠杆菌O血清型鉴定将纯化的大肠杆菌接种于普通液体培养基中，置恒温摇床中培养20h，经121℃高压2h，制备O抗原。取洁净玻片，吸取O抗原滴于玻片两端，一滴加入10μL抗O血清，一滴加入等量生理盐水。轻轻晃动玻片，倾斜玻片30°于1min内观察试验现象。参照附录B表1判定，出现“++”及以上凝集反应判定阳性结果。见图3。图3大肠杆菌O血清型鉴定结果5.2.6分离菌株16SrDNA序列测定提取分离菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA序列。引物序列见附录B。PCR反应体系为模板（基因组DNA20ng/μL~50ng/μL）2μL，2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（20μmol/L）各1μL，符合（GB/T6682）ddH2O72℃、5min。通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。片段大小约1500bp回收并纯化PCR产物，送生物公司测序。图4PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定结果M：DL2000Marker；-：阴性对照；1：样本1；2：样本2；5.3结果判定使用NCBI中的BLAST进行检索，是否与数据库序列一致，即可判定，见图5。图5测序结果比对图5.4废弃物与病料处理方法废弃物参照GB39707的有关规定处理诊疗废弃物。5.5注意事项5.5.1所有操作应严格遵守生物安全规定。5.5.2鉴定或测定时，若采用商品化的培养基、生化试验鉴6.1环境卫生应按NY/T388的规定执行。夏季食槽和水槽应及时清6.2生物安全生产区内不得饲养其他动物，不应屠宰和解剖病死驴，不带入其他畜产品。料库应有防鼠防鸟设施。6.3.1妊娠母驴做好孕驴产前和产后护理工作，将临产母驴提前转入消毒好的专用产舍。接产人员应消毒。产后及时清理胎衣和其它排泄物并彻底消毒。寒冷季节做好产房保温。6.3.2驴驹产后及时做好驴驹脐部消毒工作。驴驹吸吮初乳前，对乳区进行消毒，确保新生驴驹吃到足够初乳。驴驹断奶前应提前做好补料，预防断奶应激。驴驹设置独立圈舍，并保持圈舍干燥、清洁。秋冬季新生驴驹应做好保暖工作。6.4药物预防根据流行病学调查结果，发病率高驴厂，在分娩前3d~5d给予母驴微生态制剂或中兽药。7.1.1如果出现脱水、衰弱、食欲废绝、粪便水样、腥臭等严重临诊症状的，应及时治疗。7.1.2口服、注射方式投入兽药应符合NY/T5030的要求。7.1.3抗菌药物的使用应根据实验室药敏试验结果，科学规范使用。7.1.4如果仅出现粪便发软，采食量少等情况无需治疗。7.2方法对因治疗：根据药敏试验结果选择合适药物。消化道给药：口服或灌肠庆大霉素,磺胺脒等敏感药物。静脉注射或肌肉注射：庆大霉素、头孢类药物、氨基糖苷类药物。根据脱水程度，补充葡萄糖、钠制剂、钾制剂和维生素，调整胃肠机能。冬季补液应加温。对症治疗：对症治疗是治疗本病的关键，患病驴常因心力衰竭、酸中毒、内毒素中毒等引起死亡，因此应积极进行对症治疗，如止血、维护心脏功能、解毒、缓解酸中毒和止泻等。推荐药物、用量及方法：针对消化道炎症用药，维生素B和维生素K，西咪替丁。出现心力衰竭的，可注射强心药如强尔心、西地兰等，出现内毒素中毒的，可注射盐酸上莨菪碱（654-2）、维生素C地塞米松、氢化可的松等；出现酸中毒的，可静脉注射5%碳酸钠注射液，止泻可内服中药止泻散，西药如矽炭银、次硝酸铋、鞣酸蛋白、药用炭等。8病死驴及病害驴处理应按《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发[2017]25号）的规定执行。9档案管理9.1记录记录应统一、规范。记录内容包括驴的年龄，发病时间及症状、药品使用、药品的生产场家、生产日期、剂量、疗程、消毒、免疫、实验室检测结果、疗效及停药时间。9.2存档各种记录保存期限不低于两年，并分类保存。六.第三方检测机构验证结论本标准涉及检测内容分别由山东省农业科学院家禽研究所检测中心，冠县冠康动物检测服务有限公司和山东润达检测技术有限公司等3家检测机构进行检测验证。检测结果均与《驴驹大肠杆菌病防治技术规程》编制说明提供的实验数据保持一致（详细内容参见附件）。（三）制定本标准的主要依据生物安全通用要求GB39707医疗废物处理处置污染控制标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T388畜禽场环境质量标准NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T5027无公害食品畜禽饮用水水质NY/T5030无公害农产品兽药使用准则《病死及病害动物无害化处理技术规范》2017年7月32015年~2017年期间，标准起草单位对49个规模化驴场新生驴驹的调查结果显示：0月~6月龄驴驹腹泻病的场发病率约为67.3%（33/49），驴驹个体发病率超过21.6%（1099/4755），其中高发日龄为15d~45d，大部分幼驹腹泻后经抗生素治疗效果不佳，约有15%的病例在发病48h~72h内死亡，部分驴场幼驹发病率高达80%，病死率超过~30%，给规模化驴场带来了巨大的经济损失，严重影响到驴产业的健康持续发展。大肠杆菌的耐药性问题在规模化驴场同样突出。在20世纪70年代和80年代，大肠杆菌的耐药性并不高；然而，在20世纪90年代以后呈明显线性增长趋势。从驴场分离到的大肠杆菌菌株，耐药性分析结果进一步表明该趋势的严重性。通过药敏片试验和全自动细菌鉴定分析，结果发现驴源E.coli的敏感药物有阿米卡星、妥布霉素等、耐药药物有头孢西汀、氨苄西林等。相关结果为规模化驴场治疗大肠杆菌使用抗生素提供技术指导，尤其在药物使用方面，避免或减少使用抗菌药物，使抗菌药物在临床上得到科学使用，减少无效抗生素的使用及其造成的药物残留，为畜产品的安全生产提供有力的科学保障，同时还节省了对应的治疗成本。研究还发现驴场大肠杆菌的来源复杂：大肠杆菌16SrDNA序列生物信息学分析结果表明7株驴源E.coli分离株之间的同源性为98.2%~99.7%，与牛、马、猪、禽和人源菌97.7%~99.6%，95.8%~97.3%和98.8%~99.9%。亲缘关系分析可阐明驴源分离株之间同源性差异较大，与其它动物的差异也比较明显，与牛源、人源的同源性较高，提示其感染来源可能有两类：养驴场内部与其密切接触的相关工作人员，本区域内牛腹泻型大肠杆菌的感染和传播。因此，做好养驴场的生物安全工作，避免以大肠杆菌为例的牛-驴-人之间的循环与传播；进而提示与马源的大肠杆菌的亲缘关系较远，可能虽然是同属于马属动物，但是由于不同的养殖模式导致了其互相接触感染的机会较少。以规模化养驴为基础的驴产业，在发展过程中幼驹大肠杆菌病的威胁日益增加，有必要制定科学、标准和规范的防治技术规程，在规模化驴场有效防控该病，保障驴产业健康发展。四、与现行相关法律、行政法规和其他标准的关系为了更好地贯彻《中华人民共和国畜牧法》《中华人民共和国动物防疫法》，特制定了《驴驹大肠杆菌病防治技术规程》。本标准制定发布后，将提高我省驴产业对该病的综合防治水平。制定和实施本规程有助于建立健全驴场的科学防治体系和生物安全体系，避免耐药性大肠杆菌在规模驴场的传播，维护公众健康，同时为药品和食品行业提供优质、健康和安全的原材料做出基础性贡献。五、重大分歧意见的处理过程、处理意见及其依据本标准无重大分歧意见。六、对地方标准自发布日期至实施日期之间的过渡期的建议及理由本标准发布后，为了有效贯彻实施之，建议有关部门加强实施推广，使相关人员充分了解标准的各项条款，改变目前我省驴驹大肠杆菌病诊断与防控过程中各个环节存在的无标可依的现状。七、其他需要说明的内容提出部门（盖章）参考文献[1]王仁虎.引起驴驹腹泻的致病性大肠杆菌分离鉴定及复合疫苗研[2]夏楠.腹泻型驴源大肠杆菌毒力因子及全基因组分析[D].聊城大[3]刘宪斌，王仁虎，姜桂苗等.规模驴场主要传染性疫病的流行特[4]朱曼玲,齐鹏飞,丁召亮等.山东一规模化驴场主要细菌病的流行[5]冯培祥，杨莉，庄桂玉等.致驴驹腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药[7]王莹.致驴驹腹泻的大肠杆菌分离鉴定及临床治疗[D].吉林大[8]王莹，买买提·吐尼牙孜，李爽等.引菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2022(05):68-72+135-138.[9]冯培祥，杨莉，庄桂玉等.致驴驹腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药antimicrobialsusceptibiepidemiologyofequineinfluenzainandspatialtrends[J].detectedinthefecesofdiarcomprehensivemolecularstudy[J].Equineveterinaryjournal,2014,bacteriaandmetabolicparametersinfoalsduringthefirstsixweeksEscherichiacoli[J].Brazilianjournalofmicrobiology,2016,47].InternationaljournalfofEscherichiacoliOantigens[J].FEMSmicrobiologyreviews,conferslysozymeresistancetoextraintestinalpathogenic[22]VONBAUMH,MARRER.AntimicrobialresistanceofEscherichia[23]SZMOLKAA,NAGYB.MultidrugresistantEscherichiacoliinanimalsanditsimpaMicrobiol,2013,4:inoculationoffoalsandpigswithanenterotoxigenicE.coliisolated1附表1大肠杆菌PCR产物测序结果GAGGCGGGGGCTACACATGCAGTCGAACGGTAACAGG