备课素材：PCR引物设计的原则-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

PCR引物设计的原则PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要两种引物。一种与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另—种与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键，因此，PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。因此，引物的设计需要把握以下原则：①引物长度要适宜一般，引物的长度为15-23bp，常用的长度为18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq

酶进行反应。过短则特异性差。②引物GC含量要适宜a.引物3'端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。

b.3'端防止连续三个C或G，引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。c.上下游引物的GC含量不能相差太大。③引物自身及引物之间不应存在互补序列碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。④引物5'端可以修饰，3'端不可修饰a.引物的5'

端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。b.引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。c.在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。引物5`端链接限制酶的识别序列（两种引物两种限制酶）双酶切优点：防止自连⑤退火温度要适宜退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。原因：如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。例1．科研人员将目的基因J与质粒构建重组表达载体，该质粒的部分结构如图所示，下列叙述错误的是（

）A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等B．与图中启动子结合的酶是RNA聚合酶C．用PCR检测J基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2D．若J基因转录的链位于b链，可知引物F1与基因J的b链相应部分序列相同解析：A、图中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确；B、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，B正确；C、引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2，C正确；D、b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，D错误。故选D。2.通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述不正确的是（

）A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入B．一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同C．第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4解析：A、引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入运载体，避免发生自身环化，A正确；B、第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，一个DNA分子在第2轮PCR后，得到的四个DNA分子各不相同，B正确；C、在第3轮PCR中，物质②是引物2以引物1拓展得到的DNA链为模板进行复制得到的，故引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因，C错误；D、在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D正确。故选C。3.编码基因的特异性定点突变可通过PCR方法替换个别核苷酸获得突变基因。在PCR法中共设计有4条引物，其中一组引物用来引入特定的突变（引物2和3，个别核苷酸差异不影响引物与模板链的结合）。首先，为防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对

、

用于合成PCR产物1和PCR产物2；然后，将PCR产物1和2加入无引物的PCR反应体系得到含有定点突变的目的基因，再用引物1+引物4扩增目的基因得到大量的点突变目的基因。为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，对引物1和引物4的要求是。解析：据图PCR产物1和PCR产物2的位置分析可知道，为了防止引物相互杂交，需要设计两个反应体系，分别加入引物对为1+2和3+4；因为目的基因两侧没有某种限制酶的酶切位点，所以为了使扩增的目的基因两侧能被某种限制酶酶切形成黏性末端，应该在引物1和4均带上该限制酶识别序列。4.下图为目的基因部分序列：

应选择的一对引物是：

A．5’-ATGACAGTTAGT-3’

B．5’-TACTGCCGGTGA-3’C．5’-TCACCGGCAGTA-3’

D．5’-ACTAACTGTCAT-3’

如上图所示，构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择

识别切割质粒，再用

连接。已知目的基因上无相关酶切位点，应在引物的

（填“5’”或“3’”）端设计酶切序列，目的基因上游设计的酶切序列+引物序列为5’-

-3’。已知DUR1，2基因的转录模板链为A链，若DUR1，2基因反向连接，构建出反义DUR1，2基因，则其转录模板链为

链。造成的结果是转反义DUR1，2基因酵母工程菌中内源的DUR1，2基因表达受阻，原因可能是

。解析：PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，AC正确，BD错误。故选AC。由图可知，在强启动子和终止子中间含有限制酶EcoRI和BamHI的识别位点，因此构建基因表达载体时为避免反向拼接应选择EcoRI和BamHI识别切割质粒，再用DNA连接酶进行连接。引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故应在引物的5’端设计酶切序列，扩增目的基因时其右边需要添加EcoRI识别序列5'-GAATTC-3'，且引物需要与模板链碱基序列3'端进行互补配对，故