药物萃取技术-反胶团萃取技术（制药技术课件）

反胶团萃取概述大纲1.反胶团的形成及特征2.反胶团的构造3.反胶团的分类概述--反胶团萃取技术（萃取技术）

表面活性剂：是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。

胶束的形成：当表面活性剂在溶剂中的浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，表面活性剂就聚集形成胶团。1.反胶团的形成及特征（1）反胶团的形成概述--反胶团萃取技术（萃取技术）正向胶团：表面活性剂分子在极性溶剂（如水）中形成的一种亲水基团朝外，而疏水基团朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。水非极性的“核”极性“头”非极性“尾”概述--反胶团萃取技术（萃取技术）1.反胶团的形成及特征（1）反胶团的形成反向胶团：在有机溶剂中形成亲水基团向内，疏水基团向外的含有水分子内核的聚集体，即反胶团。非极性有机溶剂极性“头”极性的“核”

po1arcore非极性“尾”反微团内溶解的水称为微水相或水池概述--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）反胶团的形成1.反胶团的形成及特征（3）反胶团

反胶团体系由水、有机相及表面活性剂组成，是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的一种具有微水池结构的油包水微乳液。反胶团：是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的、内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。

1.反胶团的形成及特征概述--反胶团萃取技术（萃取技术）（4）反胶团萃取技术优点①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；②分离、浓缩可同时进行，过程简便；③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；④由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；⑤反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。1.反胶团的形成及特征概述--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）反胶团的构造2.反胶团的构造表面活性剂的不同聚集体概述--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）反胶团的构造2.反胶团的构造正胶团、反胶团示意图概述--反胶团萃取技术（萃取技术）

(2)形成反胶团常用的表面活性剂的种类

表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，有三类表面活性剂都可在非极性溶剂中形成反胶团。

阴离子表面活性剂：AOT

阳离子表面活性剂：CTAB

非极性有机溶剂：环己烷，庚烷，辛烷等分离蛋白质时，使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT。2.反胶团的构造概述--反胶团萃取技术（萃取技术）11阴离子表面活性剂AOT：丁二酸－2－乙基己基磺酸钠这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶团时不需加助表面活性剂，并且形成的反胶团较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。概述--反胶团萃取技术（萃取技术）12阳离子表面活性剂CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴

CTAB溶于有机溶剂形成反胶束时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。这是因为它们在结构上的差异造成的。概述--反胶团萃取技术（萃取技术）常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂概述--反胶团萃取技术（萃取技术）（3）助表面活性剂

蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解相对分子质量较大的蛋白质。2.反胶团的构造概述--反胶团萃取技术（萃取技术）3.反胶团体系的分类（1）单一表面活性剂反胶团体系：①阴离子型。在反胶团萃取蛋白质使用最多的是阴离子型表面活性剂（琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠，简称AOT）。适用于等电点较高的、相对分子量较小的蛋白质的分离。②阳离子型，如TOMAC（氯化三辛基甲铵）、CTAB（溴代十六烷基三甲胺）等。该体系适用于等电点较低的、相对分子量较大的蛋白质的分离。③非离子型表面活性剂，能形成更大的反胶团体系，能分离相对分子量更大的蛋白质，但这类体系容易乳化。概述--反胶团萃取技术（萃取技术）(2)混合表面活性剂反胶团体系：

是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系，一般来说，混合表面活性剂反胶团对蛋白质有更高的分离效率。(3)亲和反胶团体系：

是指除了有组成反胶团的表面活性剂以外，还有具有亲和特征的助剂，它的亲和配基与蛋白质特异性的结合，往往极少量亲和配基的加入就可使萃取蛋白质的选择性大大提高。概述--反胶团萃取技术（萃取技术）反胶团萃取设备大纲1.膜萃取器2.离心萃取器3.混合澄清槽反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）4.微分萃取设备1.膜萃取器

（1）管状超滤膜用管状陶瓷超滤膜截留含有磷脂酶的反胶团，实现了对生物产品的部分分离。含有磷酯酶的发酵液经过泵进入到陶瓷超滤膜组件中，磷酯酶被截留在膜内，萃余相则返回到反应器，从而实现磷酯酶的分离。

反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）（2）中空纤维膜

中空纤维管是另一类被广泛用于液-液分离的膜萃取器。它具有很大的比表面积，且与反胶团技术相结合能减少蛋白质的失活，是一项很有实用前景的生物分离技术。

反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）1.膜萃取器

2.离心萃取器

反胶团溶液-水-蛋白质所组成的萃取体系，由于表面活性剂的存在，界面张力低，易乳化。另外，由于萃取的目标产物是蛋白质，易变性失活。为了尽量避免蛋白质的变性，应尽量缩短操作时间，因而反胶团离心萃取是一项很合适的蛋白质萃取分离技术。

反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）3.混合澄清槽

混合-澄清式萃取器是一种最常用的液-液萃取设备，该设备由料液与萃取剂的混合器和用于两相分离的澄清器组成，可进行间歇或连续的液-液萃取。但该设备最大的缺点是反胶团相与水相相混合时，混合液易出现乳化现象，从而增加了相分离时间。反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）4.微分萃取设备（1）喷淋塔萃取器

喷淋塔是一种应用广泛的液-液微分萃取设备，具有结构简单和操作弹性大等优点，在反胶团萃取方面受到了人们的关注。尤为重要的是，当用于含有表面活性剂的反胶团体系时，所需输入的能量很低，故不易乳化，从而缩短了相分离时间。但喷淋塔的缺点是连续相易出现轴向反混，从而降低萃取效率。

反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）（2）转盘萃取塔

转盘萃取塔（RDC）可用于蛋白质的萃取分离。右图是RDC萃取蛋白质的示意图，反胶团相为分散相，水相为连续相。转盘塔的优点是单位塔高的效率高、高产量、操作弹性大和低能耗等。缺点是体系易出现乳化和返混现象。反胶团萃取设备--反胶团萃取技术（萃取技术）4.微分萃取设备反胶团萃取原理反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）大纲1.反胶团萃取原理与过程3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素2.反胶团萃取的特点1.反胶团萃取原理与过程

从宏观上看反胶团萃取，是有机相－水相间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。

微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中的反胶团微水相中的分配萃取。

从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）反胶团萃取原理

当含有蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触后，两相界面处存在着表面活性剂，且有机相内含有反胶团。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）反胶团萃取原理1.反胶团萃取原理

蛋白质进入反胶团是协同作用。

在有机相和水相相界面间的表面活性剂，同临近的蛋白质分子发生静电吸引而变性，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。

当反胶团相与含有蛋白质的水相混合，蛋白质能溶于反胶团的“水池”中。由于水和表面活性剂在蛋白质表面形成一层“水壳”，使蛋白质不与有机相接触而得到有效保护。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）1.反胶团萃取原理与过程（1）反胶团萃取原理

a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）1.反胶团萃取原理与过程（2）反胶团溶解蛋白质的形式b、半岛模型：蛋白质表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；c、蛋白质吸附于反胶团内壁；d、蛋白质疏水区与几个反胶团的疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。

水相中的溶质进入反胶团相需经历三步传质过程：

①通过表面液膜从水相到达相界面；

②在界面处溶质进入反胶团中；

③含有溶质的反胶团扩散进入有机相。反萃取操作中溶质亦经历相似的过程，只是方向相反，即在界面处溶质从反胶团内释放出来。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）（3）反胶团萃取过程1.反胶团萃取原理与过程

反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能

(1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；

(2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。

反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）1.反胶团萃取原理与过程（4）反胶团溶解蛋白质的形式反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）2.反胶团萃取的特点

（1）进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性，失活。

（2）pH、离子强度、表面活性剂浓度等（如下表）因素会对反胶团萃取产生影响。

表1决定分配系数K的分离场-分离物质间的相互作用

对分离场（反胶团）-待分离物质（生物大分子等）的相互作用加以控制，能实现对目的物质高选择性的萃取和反萃取。（3）有机相内反胶团中微水相体积最多仅占有机相的几个百分点，所以它同时也是一个浓缩操作。

（1）水相pH值对萃取的影响

表面活性剂的极性头是朝向反胶团的内部，使反胶团的内壁带有一定的电荷，而蛋白质是一种两性电解质，水相的pH值决定了蛋白质分子表面可电离基团的离子化程度，当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中；相反，当水相pH大于等电点时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃取。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（2）离子强度对萃取率的影响

离子强度的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：a.离子强度增大后，使反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；b.反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中；c.离子强度增加时，增大了离子向反胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶团内被盐析出来；d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（2）离子强度对萃取率的影响

如离子强度(KCl浓度)对萃取核糖核酸酶a,细胞色素c和溶菌酶的影响,在较低的KCl浓度下，蛋白质几乎全部被萃取，当KCl浓度高于一定值时,萃取率就开始下降，直至几乎为零。当然，不同蛋白质开始下降时的KCl浓度是不同的。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（3）助表面活性剂的影响

蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解相对分子质量较大的蛋白质。（4）溶剂体系的影响

溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有影响。常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷等）。有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（5）离子种类对萃取的影响通常反胶团中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，极性基团的电离程度愈大，反胶团内表面的电荷密度愈大，产生的反胶团也愈大。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（6）温度的影响温度是影响蛋白质萃取率的一个重要因素。一般来说,增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度，使反胶团的含水量下降,因而不利于蛋白质的萃取。通过提高温度可以实现蛋白质的反萃取。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素（7）蛋白质分子量和浓度蛋白质的分子量对其萃取率有较大影响。例如溶菌酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的分子量分别为14300、23300、35000,AOT/异辛烷反胶团萃取它们的最大萃取率分别约为100%、90%、30%,表明分子量越大的蛋白质越难萃取。用AOT反胶团体系萃取血红蛋白时发现,蛋白质浓度高时,萃取率降低;而蛋白质浓度低时,萃取率较高。反胶团萃取原理--反胶团萃取技术（萃取技术）3.影响反胶团萃取蛋白质的主要因素反胶团萃取在分离工艺中的应用大纲1.反胶团萃取的优点与应用2.反胶团萃取的应用案例反胶团萃取在分离工艺中的应用--反胶团萃取技术（萃取技术）

反胶团是表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中,当浓度超过临界胶束浓度(CMC)后,自发形成的一种亲水极性头朝内、疏水长链尾朝外的纳米级聚集体,其极性内核可增溶少量水,形成微“水池”。运用核磁共振、荧光色谱等手段对内核中水的特性研究表明,水池中的水与常态水相比,物理性质有所不同,它可以溶解某些亲水性物质,如脂肪酶、蛋白质、核酸和氨基酸等生物活性物质,而且在此基础上还可以溶解一些原本不能溶解的物质。反胶团萃取在分离工艺中的应用--反胶团萃取技术（萃取技术）1.反胶团萃取的优点与应用反胶团萃取技术的应用萃取蛋白质α-淀粉酶、细胞色素c、核糖核酸酶、溶菌酶、α-胰凝乳蛋白酶、过氧化氢酶药物反胶团超临界CO2萃取日化行业提取化妆品原料功能性添加剂植物油、氨基酸、维生素等萃取蛋白质萃取抗体萃取抗生素反胶团萃取在分离工艺中的应用--反胶团萃取技术（萃取技术）反胶团萃取在分离工艺中的应用--反胶团萃取技术（萃取技术）（1）浓缩α-淀粉酶2.反胶团萃取的应用案例反胶团萃取在分离工艺中的应用--反胶团萃取技术（萃取技术）（2）直接提取胞内酶

如用CTAB/己醇－辛烷(1：9，V/V)体系反胶团溶液从棕色固氮菌细胞悬浮液中提取、纯化胞内脱氢酶。菌体细胞在表面活性剂的作用下破裂。析出的胞内酶随即进人反胶团的水池中，再通过加入合适的溶液改变环境，酶又能被反萃取，进入水溶液。2.反胶团萃取的应用案例

反胶团萃取的另一个应用是蛋白质的复性。重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，以便从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过程通常要在极稀的溶液中进行，以避免部分复性中间体的凝集。

利用反胶团包裹变性的蛋白质，通过调整系统组成的环境参数，使得每个微胶团只包裹一个蛋白质分子，然后改变胶团溶液组成进行复性，由于蛋白质被单独装在各个胶团中，复性时完全不接触，避免了有害作用，使酶的活性完全恢复