塑料 微生物作用的评价

ICS83.080.01

CCSG31

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXXX—202X/ISO846:2019

`

塑料微生物作用的评价

Plastics—Evalutionoftheactionofmicroorganisms

(ISO846:2019,IDT)

（征求意见稿）

（本草案完成时间：2023-06-30）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

GB/TXXXXX—202X/ISO846:2019

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件等同采用ISO846:2019《塑料微生物作用的评价》。

本文件做了下列最小限度的编辑性改动：

——表1、表2和表D.1中列出了与测试菌种等同的国内菌株号，并以表注的形式加以说明。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中国石油和化学工业联合会提出。

本文件由全国塑料标准化技术委员会（SAC/TC15）归口。

本文件起草单位：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、广东迪美生物技术

有限公司、广州合成材料研究院有限公司等。

本文件主要起草人：谢小保等。

III

GB/TXXXXX—202X/ISO846:2019

引言

在一定的气候和环境条件下，微生物能在塑料或塑料产品的表面生长繁殖。它们和/或它们的代谢

产物不仅能损坏塑料本身，而且还能影响建筑材料和包含塑料部件的系统的效用。

本文件中规定的试验和试验条件是以实验为依据的的，并且涵盖了大多数但并非所有潜在应用。

对于特定的应用和长期试验，应就反映实际条件下性能的程序达成一致。

塑料上微生物的作用包含以下两个过程。

a)直接作用：微生物将塑料作为生长营养物质而使塑料劣化。

b)间接作用：微生物代谢产物对塑料的影响作用，例如变色或进一步劣化。

本文件涉及这两个过程以及它们的综合作用。

基于测试的实验室之间至少5年讨论的基础上对方法进行了更改。在国际层面上，国际生物劣化研

究小组（IBRG）的塑料小组内部进行了讨论，这些科学家对本文件以及微生物与塑料之间的相互作用的

测试有着丰富的经验。

IV

GB/TXXXXX—202X/ISO846:2019

塑料微生物作用的评价

警告：对潜在危险微生物的处理和操作需要很高的技术能力。只有经过微生物技术培训的人员才能

进行此试验，并严格遵守相关的消毒，灭菌和个人卫生操作规程。建议实验人员参照GB/T2423.16和ISO

7218。

1范围

本文件规定了由真菌，细菌和土壤微生物的作用而引起的塑料劣化的测定方法。其目的不是确定塑

料的生物降解性或天然纤维复合材料的劣化。

劣化的类型和程度可以通过以下方式确定：

a)目视检查；

b)质量的变化；

c)其他物理性质的变化。

本试验方法适用于所有表面平坦且易于清洁的塑料。多孔材料除外，例如塑料泡沫。

本文件与GB/T2423.16使用相同的试验真菌。GB/T2423.16的“组装样品”要求使用孢子悬浮液

对样品进行接种并孵育，评估真菌的生长及其对样品的物理腐蚀。

使用的试验菌株和测试量取决于塑料的预期应用。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

IEC60068-2-10环境试验第2部分：试验方法试验J和导则：长霉（Environmentaltesting—

Part2-10:Tests—TestJandguidance:Mouldgrowth）

注：GB/T2423.16—2022环境试验第2部分：试验方法试验J和导则：长霉（IEC60068-2-10：2018，IDT）

ISO13934-1:2013纺织品织物拉伸特性使用条样法测定最大受力和最大受力时的伸长率

（Textiles—Tensilepropertiesoffabrics—Part1:Determinationofmaximumforceand

elongationatmaximumforceusingthestripmethod）

注：GB/T3923.1-2013纺织品织物拉伸性能第1部分：断裂强力和断裂伸长率的测定（条样法）（ISO13934-

1:1999，MOD）

EN10088-1不锈钢第1部分：不锈钢名单（Stainlesssteels—Part1:Listofstainless

steels）

EN10088-2不锈钢第2部分：一般用途耐腐蚀薄板、中板和带材交货技术条件（Stainlesssteels

—Part2:Technicaldeliveryconditionsforsheet/plateandstripcorrosionresisting

steelsforgeneralpurposes）

EN13697:2015+A1:2019化学消毒剂和防腐剂食品、工业、家庭和研究所使用的化学消毒剂杀

菌和/或杀真菌性能定量无孔表面评定试验无机械动作试验方法和要求(阶段2/步骤2)（Chemical

disinfectantsandantiseptics—Quantitativenon-poroussurfacetestfortheevaluationof

bactericidaland/orfungicidalactivityofchemicaldisinfectantsusedinfood,industrial,

1

GB/TXXXXX—202X/ISO846:2019

domesticandinstitutionalareas—Testmethodandrequirementswithoutmechanicalaction

(phase2,step2)）

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

生物劣化biodeterioration

由于微生物的作用，材料的特性（例如颜色，强度，质量）发生了改变。

抗真菌作用fungistaticeffect

经抗菌处理的材料在潮湿条件下防止真菌过度生长的效果。

4原理

通则

在规定的温度或湿度条件下，将塑料试样在特定的真菌和细菌等试验菌种（或在土壤填埋试验时，

暴露于微生物活性的土壤）环境中暴露一定时间。在试验结束后，在清洁之前和/或之后通过目视检查

和/或测定质量或任何其他物理性质的变化来评估试样。

在相同试验条件下，将微生物接种的试样组（I组）同未处理的试样组（0组）获得的结果或无菌试

样组（S组）获得的结果进行比较。

测试抗真菌性能时，对不含杀菌剂的试样与含杀菌剂的试样进行目视评估比较，以定性方式证明杀

菌剂的效果。

4.2至4.4简要说明了用于测定塑料对真菌的抗性（方法A）或抗真菌作用（方法B）、对细菌的抗性

（方法C）和对土壤微生物的抗性（方法D）的试验方法。

抗真菌试验

4.2.1方法A：真菌生长试验

在相对湿度≥95％的条件下，将试样暴露于含有真菌孢子的混悬液中。当真菌孢子出芽生长消耗自

身的养分后，只能以消耗试样中的营养成进行生长。如果试样不含营养成分，则真菌不会产生菌丝体，

并且塑料也不会变质。

方法A适用于评价在没有其他有机质的情况下塑料对真菌侵蚀的固有抗性。

4.2.2方法B：抗真菌作用

在完全营养的培养基中，即在有碳源的情况下，将试样暴露于含真菌孢子的混合悬浮液中。即使塑

料不包含任何营养成分，真菌也可以通过代谢培养基中的营养成分而在其上生长，它们的代谢产物也可

以侵蚀塑料。

在塑料上或在营养琼脂培养基上的任何生长抑制（抑菌圈）均显示塑料的抗真菌性能或存在杀菌剂。

为了表征杀菌剂在塑料中的定性作用，测试中应包括不含杀菌剂的试样。只有不含杀菌剂的试样比

含有杀菌剂的试样显示出更多的生长，才能定性试样的抗真菌或杀真菌效果。

方法C：抗细菌试验

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使用不含碳源的不完全培养基评价细菌对试样的作用1)。如果试样周围的琼脂没有生长，则试样不

包含任何营养成分。

如果要测试的材料具有其他功能，例如具有卫生效果的产品，建议根据ISO22196对塑料材料进行

测试，该文件提供了经杀菌剂处理的无孔(塑料)材料的抗菌活性的测定方法。

方法D：抗微生物活性土壤试验（土壤填埋试验）

将试样完全埋入具有已知持水量和规定含水量的天然土壤中（见附录A）。

由于许多塑料在高湿环境下应用并与土壤长期接触，因此本文件包含土壤填埋试验。

生物劣化评价性能的选择

根据试验目的选择测定的性能。在塑料抗性评估的第一阶段，应采用目视评估塑料生物侵蚀。

建议测定外观（如表面光泽）、弯曲性能、抗冲击和硬度等性能变化。

5仪器和材料

适用于所有试验

5.1.1培养箱：在相对湿度≥95％的条件下，温度能控制在29℃±1℃。

5.1.2烘箱：温度能控制在45℃±1℃（用于干燥试样）和104℃±1℃（用于测定土壤持水能力）。

5.1.3气候箱：能维持标准的温度和湿度条件（23℃和50％R.H.），以调节试验和对照样。

5.1.4压力蒸汽灭菌器：能分别维持120℃的温度和0.2MPa的压力，用于对玻璃容器、玻璃培养

皿或土壤进行灭菌。

5.1.5分析天平：精度0.1mg。

5.1.6实验室离心机。

5.1.7体视显微镜：放大倍数50。

5.1.8一次性玻璃或塑料培养皿：带有通风盖，尺寸适合于试样。

5.1.9带盖的玻璃容器：容量至少为1L（高度约16cm；直径约11cm），并有足够的空间在培养皿

下方设置水槽。

5.1.10蒸馏水或去离子水

用于制备所有溶液和培养基以及用于所有测定的水应为蒸馏水或去离子水，其电导率应小于1

μS/cm。

5.1.11消毒液：乙醇与水的混合物，质量比为70:30。

5.1.12不锈钢试样（方法A）

应为1.4301（符合EN10088-1的要求）不锈钢圆片（直径约2cm），两面均为2B级（符合EN10088-

2的要求）。表面应尽可能平整，不锈钢的厚度应为1.2mm或1.5mm。

1)培养基中使用的琼脂需要碳含量非常低

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注：通常能购买到合适的不锈钢圆片，国内对应牌号为06Cr19Ni10（数字代号为S30408）。

5.1.13布氏漏斗：带有烧结过滤器

5.1.14网格（5mm×5mm）：刻在透明载体（如玻璃或塑料）上，用于评估真菌在试样表面的定殖。

5.1.15邻苯基苯酚溶液

将1g邻苯基苯酚溶于50mL的90％乙醇中，加水至1000mL，并滴加乳酸将pH值调至3.5。

适用于真菌试验

5.2.1试验真菌

应从国家菌种保藏中心获得试验真菌。表1列出了所使用的菌株，并应在试验报告中注明。附录D中

列出了与表1相同的真菌菌株的菌种保藏中心和菌株编号。

表1非电子设备使用的测试塑料要使用的真菌菌株

名称菌株号

黑曲霉（Aspergillusniger）CGMCC3.3928（ATCC6275）

嗜松青霉（Penicilliumpinophilum）CGMCC3.3875（ATCC36839）

宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）CGMCC3.2762（ATCC18502）

绿色木霉（Trichodermavirens）CGMCC3.4004（ATCC9645）

球毛壳霉（Chaetomiumglobosum）CGMCC3.4254（ATCC6205）

注：CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC菌株与括号中的菌株等同。

如果由于技术原因，并经有关各方同意，可以使用其他菌种，但必须在试验报告中注明所用试验菌

株。

若对用于电子部件和电子设备的塑料进行测试时，可按IEC60068-2-10中规定的方法，使用表1所

示的黑曲霉、嗜松青霉、宛氏拟青霉、绿色木霉以及表2中的3种菌株。

表2测试电子产品时使用的真菌菌株

名称菌株号

黑曲霉（Aspergillusniger）CGMCC3.3928（ATCC6275）

嗜松青霉（Penicilliumpinophilum）CGMCC3.3875（ATCC36839）

宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）CGMCC3.2762（ATCC18502）

绿色木霉（Trichodermavirens）CGMCC3.4004（ATCC9645）

球毛壳霉（Chaetomiumglobosum）CGMCC3.4254（ATCC6205）

土曲霉（Aspergillusterreus）CGMCC3.3900（ATCC10690）

树脂枝孢霉（Hormoconisresinae）CICC2536（DSM1203）

短柄帚霉（Scopulariopsisbrevicaulis）CICC2483（ATCC36840）

注1：CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC菌株与括号中的菌株等同。

注2：CICC为中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC菌株与括号中的菌株等同。

5.2.2菌种保藏

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在含有以下成分的麦芽提取物琼脂斜面或培养皿中培养试验真菌（5.2.1）。培养基配制方法如下：

麦芽提取物30g

琼脂20g

水1000mL

在高压蒸汽灭菌锅中于120℃±1℃灭菌20min。

在29℃±1℃下培养，形成具有活性的孢子。在此温度下，孢子保藏时间不应超过28d。

由于在人工培养基上培养的过程中真菌可能会发生遗传和生理变化，因此应通过适当的措施（如将

培养物冷冻干燥，于4℃或液氮中或-70℃低温磁珠上保存）将传代培养的时间间隔减少到最低限度。

5.2.3溶液和营养培养基

5.2.3.1无机盐储存液成分如下（仅使用分析纯或同等纯度的化学品）：

NaNO33.0g

KH2PO40.7g

K2HPO40.3g

KCI0.5g

MgSO4⋅7H2O0.5g

FeSO4⋅7H2O0.01g

H2O1000mL

用无菌的0.01mol/L的NaOH溶液调整pH值至6.0～6.5。

5.2.3.2无机盐润湿剂溶液:在1L无机盐储存液（5.2.3.1）中加入0.1g无毒的润湿剂（例如N-

甲基牛磺酸或聚乙二醇醚），并在120℃±1℃的压力蒸汽灭菌器中灭菌20min。

5.2.3.3无机盐葡萄糖溶液:在1L无机盐储存液（5.2.3.1）中加入30g±1g葡萄糖，并在115℃

±1℃的压力蒸汽灭菌器中灭菌30min。

5.2.3.4不完全琼脂培养基:在1L无机盐储存液（5.2.3.1）中加入20g琼脂。搅拌并加热煮沸，

使琼脂溶解，在120℃±1℃的压力蒸汽灭菌器中灭菌20min。用无菌0.01mol/L的NaOH溶液调整

pH值至6.0～6.5。

5.2.3.5完全琼脂培养基:在不完全琼脂培养基（5.2.3.4）中加入30g±1g葡萄糖，并在115℃

±1℃的压力蒸汽灭菌器中灭菌30min。灭菌后，在20℃条件下用无菌的0.01mol/L的NaOH溶液

调整pH值至6.0～6.5。

适用于细菌试验

5.3.1试验细菌:铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa),NCTC8060或ATCC13388。

试验细菌菌株应从国家菌种保藏中心获得。如果双方同意使用其他的试验细菌，使用的菌种应在试

验报告中注明。

5.3.2营养培养基和溶液

5.3.2.1大豆酪蛋白胨琼脂:根据制造商的说明进行制备。可以购买商品培养基。

5.3.2.2无菌缓冲溶液:在20℃时的pH值为7.0。

分别制备以下两种溶液：

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KH2PO49.1g/L（溶液A）

Na2HPO411.9g/L（溶液B）

将600mL溶液A与400mL溶液B混合，在120℃±1℃的压力蒸汽灭菌器中灭菌20min，在

20℃条件下用0.01mol/L的NaOH溶液调整pH值至7.0。

适用于土壤填埋试验

使用具有持水力的活性土壤，水分含量为（60±5）％（按照附录A）。

持水力是土壤水饱和时的含水量。

土壤用水浸提的提取液（20g水中含有1g土壤）的pH值应为4.0～7.0。

按照附录A测定土壤的水分含量和持水力。如果土壤的水分含量超过上述数值，则在实验室环境条

件下将其铺成薄层晾干。禁止加热或干燥土壤，因为这会影响土壤微生物菌群。如需要提高水分含量，

使用每升含有1g硝酸铵和0.2g磷酸氢二钾的水溶液进行调整。

6试样

形状和尺寸

试样的形状和尺寸可由试验中试样暴露于真菌、细菌和土壤情况来确定。

如需测定试样的厚度的变化，需从原始材料中制备试样，如试样在使用前需成型制备，则试样的最

大厚度为0.5mm。

如需测定试样质量的变化，则使用尺寸为（50±1）mm×（50±1）mm的正方形试样，厚度宜为0.5

mm～2mm。

由于微生物生长会侵蚀试样的表面，因此只能比较相同尺寸样品的结果。

试样组和试样组号

6.2.1试样组

6.2.1.1对每个试样和每种试验方法，准备3组试样：

——0组：对照试样，在标准温度和标准湿度条件下保存，至少2个试样；

——S组：无菌试样，在与I组相同的条件下保存，至少2个试样；

——I组：接种微生物并已培养的试样。根据试验目的，每个子试验组a和/或b（见表3）至少

有5个试样。

6.2.1.2子试验组a（不含杀菌剂）和子试验组b（含杀菌剂）

如果试样包含杀菌剂，并且试验旨在显示活性物质的杀菌功效，以保护材料免受生物降解，则对于

I组试验，必须测试两组试样：不含杀菌剂试验组（试验组a）和含有杀菌剂试验组（试验组b）。因此，

总共需要接种10个试样。理想情况下，除了杀菌剂含量外，这些试样完全相同。该试验可以证明试样的

防腐效果。

6.2.1.3子试验组c（仅适用于方法A）：不锈钢试片作为阴性对照（最少3个试样）

对照样由不含真菌所需营养的耐腐蚀的不锈钢组成。以与I组中的试样相同的方式进行接种，孵育

和评估（见表4）。如果对照样表面有真菌生长，则表明营养成分已经随接种物转移到了对照试样的表

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面上。这些阴性对照试样的任何生长都应按表4进行报告，以及生长是否大于或小于I组中其他接种试样

的生长。

6.2.2每组试样的数量

目视检查外观时，每个塑料样品和每种试验方法至少制备11个样品。此外，如果按照本文件的方

法A进行测试，则准备3个阴性对照样（不锈钢），如果按照方法B测试杀菌效果，则制备5个不含杀菌

剂的试样作为阳性对照。应按照EN13697清洁试样。

注：EN13697中所述的清洁过程可确保试样上没有残留油脂。

测定质量变化时，每个试验组至少要制备6个试样，即每个样品和每种试验方法至少制备18个试样。

对于其他评估方法，使用的试样数量根据相关标准规定来确定。

每次评估的试验过程应分别进行。但是，用于测定质量或其他物理性质变化的试样也可以用于外观

检查。

7试样准备

清洁

如果乙醇对试样没有影响，将方法A和C的试样浸入消毒液（5.1.11）中1min，然后在无菌条件下

于45℃干燥4h或在室温下干燥72h。如果乙醇对试样有影响，将试样存放在无菌的容器中，并用无菌

镊子夹取试样。以后的试验都要用无菌镊子夹取试样以避免有机物污染试样。

方法A的阴性对照金属试样需要按照EN13697:2015中的5.2.3（按照附录B）进行清洁。

无需清洁方法B或D的试样。

标记和储存

室温下，将清洁和标记（或标签）的样品存放在培养皿（5.1.8）中。

在试验过程中，标记或标签可能会导致塑料发生表面反应。在这种情况下，请将试样单独存放在合

适的容器（如培养皿）中，并标记培养皿而不是标记试样，以避免发生表面反应。在其他情况下，可以

使用合适的标记器直接标记试样。

状态调节和称量

在室温下，将用于测定质量变化的每组试样存放在干燥器中，直到每个样品的质量变化（m1、m2、

m3等）恒定至±0.1mg（通常在48h后）。记录每个样品的质量。除非另有协议，否则在此阶段不需要

进行目视检查和/或测定质量以外的物理特性变化。

经相关方商定，可将试样存放在45℃的干燥器中。在这种情况下，使用前将硅胶冷却至室温，然

后于20℃±1℃和（65±3）％RH的条件下存放至质量恒定。应在试验报告中注明此操作程序。

8试验步骤

试验温度

在室温下准备和评估样品，并在29℃±1℃下孵育。

试验方法

8.2.1概述

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表3列出了试验方法的总体方案。测定的性能和方法的选择取决于所测试的材料和所预期的使用条

件。

表3试验方法

真菌试验细菌试验土埋试验

方法ABCD

条款8.2.28.2.38.2.48.2.5

非完全培养基

完全培养基

培养基无培养基（5.2.3.4），按土壤（见5.4）

（5.2.3.5）

8.2.4.5接种

试验组ISISISIS

子试验组aa，cbaa,bc

试样上喷洒的溶液cSp-SMs-SSp-SMs-S无Ms-S无Ms-S

培养条件29℃±1℃

28d或以上相对湿度≥95%d

Sp-S——孢子悬浮液；

Ms-S——杀菌溶液。

注：在此表中，“I”表示已接种试样，“S”表示无菌试样。

a试样（有或没有杀菌剂）。

b阴性对照样（不锈钢试样）。

c无杀菌剂的试样（理想情况下，这些试样应与a1相同，但无杀菌剂）。

d该湿度是通过方法A中的恒温恒湿试验箱以及方法B和C中的琼脂培养基实现的。对于方法D，当土壤水分和

温度符合标准且玻璃容器有盖时，可以达到该相对湿度。在试验装置中使用经过校准的数据记录仪确认相对湿

度。

8.2.2真菌生长试验（方法A）

8.2.2.1试样在恒温恒湿箱中的放置

8.2.2.1.1恒温恒湿箱的准备

一个能使试样在（95±5）％RH下孵育的恒温恒湿箱。

注：当将装有试样的培养皿放在储水容器内的水面上方时，例如，通过将其放在密闭容器中水上方的不锈钢网上，

可以产生高湿度。

8.2.2.1.2将试样置于恒温恒湿箱

将试样分别放入培养皿中，并尽可能平放在培养皿底部，避免试样之间以及试样与培养皿壁接触。

盖上培养皿盖，让潮湿的空气进入培养皿。

将准备好的培养皿按要求随机分成2个试验组。

如果试样从培养皿的底部向上翘起，可以使用惰性负载物（如由玻璃或不锈钢制成）将试样边缘（外

部5mm）的区域尽量保持平整。

8.2.2.2孢子悬液的制备

8.2.2.2.1概述

8

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使用无机盐/润湿溶液（5.2.3.2），从孢子形成良好的培养物制备孢子悬液。

8.2.2.2.2孢子收集

向每个培养管或培养皿（见5.2.2）中加入5mL无机盐/湿润溶液。用无菌工具（如接种针）轻轻

刮擦孢子培养物的表面，得到孢子的悬液。轻轻摇动培养管或培养皿，分散液体中的孢子，每个培养皿

重复此操作3次。然后用无菌玻璃珠摇动每种真菌培养物的孢子悬液，并通过无菌棉、玻璃棉或带有烧

结玻璃滤器的布氏漏斗过滤，以除去菌丝体碎片。

8.2.2.2.3离心洗涤孢子和制备工作悬液

将过滤后的孢子悬液进行无菌离心，弃去上清液。在沉淀物中加入25mL的无机盐溶液（5.2.3.1）

重新悬浮，然后再次离心。在洗涤后的沉淀物中加入50mL无机盐液重新悬浮。重复洗涤孢子悬液的目

的是确保去除所有可能引起某些塑料应力开裂的表面活性剂。

将悬液浓度调整为每毫升约106个孢子（使用计数板或通过比浊法测定）。

对每种试验真菌重复上述操作。将5种具有相同数量的孢子悬液等体积混合，以制备用于接种的混

合孢子悬液。制备后6h内使用孢子悬液。

注：当测试新的塑料配方时，能使用单个真菌或选定的真菌组合进行预试验。

8.2.2.3孢子活力检查

按照8.2.2.1的步骤，将完全琼脂培养基（5.2.3.5）倒入两个无菌培养皿中，并分别接种1滴混合

之前的孢子悬液。于29℃±1℃培养3d～4d（与实际试验温度相同的条件下进行活力检查）。如生

长不旺盛，则从其他培养管中制备新的孢子悬液，并重复试验。

8.2.2.4试样的接种或消毒

用吸管或喷雾器吸取0.1mL孢子悬液（8.2.2.2），向I组中的每个试样和琼脂表面均匀地接种孢子

悬液。平均每平方厘米至少接种1000个孢子，要保证在试验过程中孢子悬液不沉降或分层。

用移液管吸取3mL消毒液（5.1.11）均匀接种至S组的每个试样和琼脂表面。

8.2.2.5培养

将接种的试样和无菌对照样于29℃±1℃培养28d，或经相关方商定培养更长时间。需采取预防

措施以防止冷凝水滴落到试样表面。如果试验超过28d，按照8.2.2.2的规定，使用悬浮在无菌水中的

经过洗涤和离心的孢子，28d重新接种一次试样（见8.2.2.2.3）。

需进行外观检查时，如果在28d的培养期内肉眼可见明显的真菌生长，则可以终止试验。

试验结果为阴性，则应延长试验时间。若将试样转移到新鲜制备的琼脂基质上，并每隔28d重新接

种，这将比仅重复接种试样获得更好的结果。

8.2.3抗真菌作用的测定（方法B）

8.2.3.1倾注培养基

灭菌后，将完全琼脂培养基（5.2.3.5）倒入无菌培养皿中，使培养基厚度约为5mm，冷却凝固。

8.2.3.2试样放置

将试样分别放在培养皿中，尽可能平放在凝固的培养基上，避免试样之间以及试样与培养皿壁接触。

根据进行测试的需要，将准备好的培养皿按要求随机分为两个试验组。

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如果试样从培养皿的底部向上翘起，可以使用惰性负载物（如由玻璃或不锈钢制成）将试样边缘（外

部5mm）的区域尽量保持平整。

8.2.3.3孢子悬液制备

按照8.2.2.2规定的程序操作，但将洗涤后的沉淀物悬浮在无机盐/葡萄糖溶液（5.2.3.3）中。

8.2.3.4孢子活力检查

按照8.2.2.3规定的程序检查。

8.2.3.5试样的接种或消毒

用吸管或喷雾器吸取孢子悬液（8.2.3.3），在I组中的每个试样和琼脂表面接种适量的孢子悬液。

用移液管吸取适量消毒液（5.1.11）至S组的每个试样和琼脂表面。

8.2.3.6培养

按照8.2.2.5规定的程序进行培养。

如果相关方商定培养时间超过28d，则宜每隔28d用少量无机盐/葡萄糖溶液喷洒或移液管吸取至

试样上（5.2.3.3）。

8.2.4细菌试验（方法C）

8.2.4.1清洁试样

按7.1的程序对试样进行清洁。

用无菌钳夹取试样存放在无菌容器中，之后的步骤均用无菌钳夹取。

8.2.4.2无机盐琼脂培养基的配制

按照5.2.3.4的步骤，配制足量的培养基。

冷却至45℃，然后按照8.2.4.5进行操作。

8.2.4.3细菌悬液的制备

将准备好的琼脂培养基上的细菌（5.3.1）接种至大豆酪蛋白胨培养基（5.3.2.1），并于29℃±

1℃培养24h。使用无菌的铂、镍铬合金或塑料环将24h培养物转移至10mL无菌缓冲液（5.3.2.2）

中。用无菌缓冲液稀释至约106cells/mL溶液（如使用计数板或通过比浊法测定）。菌悬液须在1h内

使用。

不应将任何其他营养物带入菌悬液中。

8.2.4.4活性检查

在两个装有10mL无菌大豆酪蛋白胨琼脂（5.3.2.1）的培养皿中加入3滴菌悬液（8.2.4.3），并于

29℃±1℃培养24h～48h。如果两个培养皿中的细菌生长旺盛则继续试验，否则用新的菌悬液重复

试验。

8.2.4.5无机盐琼脂培养基接种

将足量的菌悬液接种至无机盐琼脂培养基（8.2.4.2），使浓度达到约5×104cells/mL琼脂。将琼脂

和菌悬液充分混合，立即倒入平板。

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8.2.4.6倾注培养基和试样放置

8.2.4.6.1试样组I（用于培养的接种试样）

将足量的接种琼脂（8.2.4.5）倒入无菌培养皿中，使琼脂厚约5mm。

琼脂凝固后，在每个琼脂表面上放置一个试样，然后倒入足量已接种的琼脂覆盖试样，使其凝固。

上层应覆盖试样的厚度约1mm。

8.2.4.6.2试样组S（无菌对照）

将未接种的无机盐琼脂（8.2.4.2）倒入无菌培养皿中。用消毒液（5.1.11）清洁消毒6个试样并将

其放在已凝固的琼脂上，并用未接种的琼脂层覆盖试样。

8.2.4.7培养

将两个试样组（I和S）在29℃±1℃和（95±5）％相对湿度下培养28d，或经过相关方商定培养

更长的时间。

在28d的培养期内肉眼明显观察到细菌生长时，若只需进行外观检查则该试验已完成。

8.2.5土壤填埋试验（方法D）

8.2.5.1土壤的生物活性

将漂白的或未漂白的未经处理的棉布条[(250±25）g/m2，（25±3）mm×（100±10）mm]埋入土壤

（见5.4），并培养7d。培养结束后，棉布条应保持小于其初始拉伸强度的25％。当土壤表现出分解纤

维素活性时，土壤菌群就达到了足够的活性。

按照ISO13934-1测定培养前后棉条的拉伸强度。

建议始终将对照棉布条与试样一起埋入，以检查土壤的生物活性。

8.2.5.2步骤

8.2.5.2.1用含水量为（60±5）％的满足持水力要求的试验土壤装满约1L的广口玻璃瓶（见5.4）。

8.2.5.2.2在每个培养期内，按图1要求，用药匙和镊子将试样埋入至少两个广口瓶中，每个广口瓶

中放入对照棉布条以检测土壤的活性（见8.2.5.1）。为了使氧气流通，在盖子和广口瓶之间放置约1mm

的金属丝环，广口瓶不应盖得太紧。

不应把广口瓶中的土壤压实。覆盖试样的土层的厚度不应大于12.5cm。测定质量损失所用的方形

试样可垂直埋入，将用于拉伸试验的试样可水平放置在较大的广口瓶中。

8.2.5.2.3对于无菌条件下进行的对照试验，将装有土壤和棉布条（见8.2.5.1）的1L的密闭玻璃广

口瓶（每次培养至少2个广口瓶）放在120℃压力蒸汽灭菌器（压力0.2MPa）中连续3d灭菌30min。

先将2个试样浸入邻苯基苯酚溶液（5.1.15）中，然后每个广口瓶中分别放入2个试样，并将3mL邻

苯基苯酚溶液倒在土壤上。

警告：为防止密封的玻璃瓶在灭菌后的冷却过程中爆裂，使用带有压力梯度的压力蒸汽灭菌器。当

使用没有压力梯度的压力蒸汽灭菌器时，在打开之前，让广口瓶冷却至约65℃。

注：土壤和试样也能使用伽马射线（25KGy）进行灭菌。

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标引序号说明：

1——玻璃罐；

2——试样；

3——土壤；

4——棉布条。

图1在土壤填埋试验中试样在土壤中的位置（横截面）

8.2.5.2.4在29℃±1℃和（95±5）％RH的培养箱中将准备好的试验广口瓶培养28d或更长时间。

注：为了防止土壤干燥，将广口瓶在高湿度下培养。

在长期土壤填埋试验期间，通过测量初始时和不同试验间隔时的广口瓶质量，测定土壤的含水量，

并适时添加1g/L硝酸铵溶液以保持含水量稳定。

28d的土壤填埋试验时间仅适用于易劣化的塑料。为了能区分不同的塑料，试验周期应延长至6个

月。为了评估塑料在建筑物、垃圾填埋垫层材料等潮湿层中的长期性能，同时进行多个平行试样测定，

并分别在6个月和12个月后取出试样，必要时，根据试样的降解程度，在18个月和24个月之后或24个月

和48个月之后取出试样。

9评价

目测评定试样上的真菌生长（方法A、B和D）

先目测试样（I组和S组），必要时使用体视显微镜观察（放大倍数为50）。

用亚甲基蓝对菌丝染色有利于观察浅色试样上的细小菌丝。该方法需要准备0.0015g/L亚甲基蓝

水溶液，用镊子将试样短时浸入溶液中。轻轻搅动溶液中的试样，然后将其取出静置约10s。为了冲洗

试样上的多余染色液，让自来水流入一个小容器中，直至溢出。将染色的试样放在容器中，不应将水直

接喷在试样上，而是保持在容器内的平缓水流中。洗去多余的染色液后，菌丝呈现浅蓝色。需要注意的

是，某些塑料也会吸收染料。使用上述方法对试样染色前，先对非测试用的塑料进行染色效果测试。当

使用此染色方法评估菌丝生长时，在试验报告上注明试样已染色。当菌丝生长在深色的试样上时，肉眼

更易观察。

按照附录C的方法进行观察，并依据表4规定的等级评估真菌的生长。对于方法B，还应报告在试样

周围的培养基中是否有无生长的区域，并报告其宽度。

12

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边缘效应：试样只有边缘有轻微的过度生长。可能有多种原因，如：

——测试材料是多层的，虽然在外表面不能过度生长，但内层能为真菌提供营养且已暴露边缘；

——真菌的菌丝似乎在试样边缘生长，但这只是在试样周围培养基上生长的菌丝的“蔓延”。

培养后出现边缘效应要报告，如果每侧宽度不超过5mm，则在真菌生长评估时不考虑边缘效应。

如果一个组中试样的目测结果出现两个以上的等级，则建议对新的试样重新测定。

清洁试样的检查（见9.2.1）可提供更多信息。

表4试样上的真菌生长评估(方法A中的阴性对照样（不锈钢）和方法B中阳性对照样（如需要）)

等级评估

0在显微镜下没有明显生长

1a

没有肉眼可见的生长，但在显微镜下清晰可见；覆盖≤25％的试样表面

1b

没有肉眼可见的生长，但在显微镜下清晰可见；覆盖≤50％的试样表面

1c

没有肉眼可见的生长，但在显微镜下清晰可见；覆盖＞50％的试样表面

2肉眼可见的生长，覆盖≤25％的试样表面

3肉眼可见的生长，覆盖≤50％的试样表面

4大量生长，覆盖＞50％的试样表面

5重度生长，覆盖整个试样表面

用于测定质量和/或其他物理性质变化的试样评估

9.2.1清洁

从琼脂上取出测试样品，将其浸入消毒液（5.1.11）中5min，在流水下漂洗，用滤纸擦净，置于

无菌培养皿中，于室温下干燥过夜。

测试结束时，使用气体（如环氧乙烷）或蒸汽（压力蒸汽灭菌器）对广口瓶中肉眼可见菌丝生长的

土壤进行灭菌。

9.2.2质量变化

为了测定试样的质量变化，将清洁的试样放在干燥器中，定期称重，精确至0.1mg，直至达到恒定

质量（通常48h）。将最终质量记录为m'1、m'2等。

注：建议按照7.3的步骤进行操作。

对于每一个试样，测定试样暴露前（见7.3）和暴露后的质量差值（Δm），如Δm1=m'1−m1。该

差值通常是负值，表示质量的损失。

测量质量变化时，接种试样和无菌对照样的尺寸应相同。

9.2.3测定其他物理性能的变化

根据相应的材料、产品或试验方法标准，测量暴露的试样和未暴露的对照样的性能（如可能同时测

定），方法如下。

按照9.2.1的规定清洁试样，并按照相关塑料标准进行状态调节。

从相关塑料标准中选择要测量的性能、试样的状态调节、试验条件和试样尺寸。

如有必要，相关方应就试验条件达成一致，并应在试验报告中注明试验条件。

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10结果表示

概述

根据每组试验结果，计算算术平均值和标准偏差。

目视评估

每个试样按表4的规定进行真菌生长等级的目测评估。

如果在清洁后增加了对试样的目视评估（见9.1），则以与真菌生长相同的方式对这些观察结果进

行评级（如，变色、形成气泡）（见表4）。

质量变化

如9.2.2所述，测定每个试样质量变化∆푚1−푛，并记录每一组的的算术平均值∆̅̅̅푚̅̅0̅、∆̅̅̅푚̅̅̅퐼，并使用公

式（1）计算质量变化平均百分比，精确到小数点后一位：

∆̅̅̅푚̅̅̅−∆̅̅푚̅̅̅̅

퐼푆×100·········································································(1)

푚̅̅̅̅푒̅

式中：

푚̅̅̅푒̅——原始试样质量的平均值。

通过统计分析（如t检验），确定样品的质量是否发生了显著变化（置信限为99％）。

只有当I组的试样与S组的试样在暴露前尺寸相同且质量相当的情况时，公式(1)才适用。

其他物理性能的变化

计算每组试样（0组、I组和S组）每个性能变化的算术平均值，分别记为V0、VI和VS。

对每一性能，根据公式（2）计算接种试样相对于灭菌试样的变化百分率：

푉̅

I×100··············································································(2)

푉̅S

对于每一性能，根据公式（3）计算接种试样与对照样相比的变化百分率：

푉̅

I×100··············································································(3)

푉̅̅0̅

第一个值比第二个值更好地表征了微生物侵蚀。

11测量准确度

所有测量均以依据的标准的精度进行。测定结果和数据计分析均在试验报告中记录（均值/标准差）。

质量、尺寸或其他物理性能变化的结果准确度将取决于试验步骤的准确度以及根据本文件进行在

暴露条件下发生的内在变异性。

目测结果的准确度很大程度上取决于进行评估的人员。因此，只有当在有照片文件时，才宜对基

于外观变化的材料进行比较。

12试验报告

测试报告应包括以下信息：

a)注明引用本文件编号；

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b)识别被测材料所需的所有信息；

c)试样的尺寸；

d)培养时间和培养温度；

e)试验方法（A、B、C或D）和试样数量；

f)试验真菌、细菌和土壤；

g)真菌、细菌菌株来源以及土壤的详细信息；

h)测得的物理性能；

i)用于测量物理性能的方法；

j)试验结果：

1)每个试样品真菌生长等级（见10.2）；

2)每个试样的质量绝对变化，单位为g，每个试验组的平均值和平均变化百分率（见10.3）；

3)每个试验组的其他性能的平均变化，加上相对于灭菌试样和对照样的变化百分率（见

10.4）；

k)任何特殊的观察结果，如被试验菌以外的真菌和细菌感染，异常的生长特征，影响孢子形成的

因素，任何变色现象；

l)与本文件的任何偏离；

m)实验室的必要信息；

n)试验日期；

o)实验室负责人的姓名和签字。

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A

A

附录A

（规范性）

土壤的含水量和持水力的测定

A.1概述

任何具有规定的纤维素分解活性（8.2.5.1）的试验土壤均可用于上述测定。商业标准土壤和商业

堆肥土壤之间的比较已显示出类似的结果。在开始试验之前，每种土壤应具有约60％持水力并在25℃～

30℃预孵育2个月～3个月。每次测定均应在该含水量下进行，以优化微生物活性。持水力为100％的

土壤，它的含水量为60％。持水力为60％和180％的土壤的含水量分别为36％和108％。

A.2含水量的测定

在3个培养皿中分别放入约50mL土壤。在104℃±1℃的烘箱中加热4h，然后在干燥器中冷却，

并在每次加热后称量，并达到恒定质量，精确至1mg。当连续两次称量的结果相差小于0.1％时，能被

认为已达到恒定质量。

对于之前使用的土壤，可以按照之前确定的干燥时间，而无需检查是否已达到恒定质量。

对于每个培养皿，如示例所示，按土壤干重的百分比计算含水量，将结果修约至1％。计算3个测定

结果的平均值。

示例：

空培养皿11.325g

湿土壤+培养皿20.475g

湿土壤9.150g

干土壤+培养皿16.600g

干土壤5.275g

含水量（干燥失重）3.875g

含水量，以土壤干重百分率计73％

A.3持水力的测定

将土壤装入3个50mL玻璃过滤器（3号过滤器，如2D3）中，土壤离器口边缘0.5cm。在木头上面墩

过滤器，高度为1cm，连续墩3次以压实土壤。

然后将每个过滤器放入玻璃烧杯中，并将水倒入烧杯中，直到水位高出过滤器1cm。当上层土壤由

于毛细管作用而变湿时，加水直至漫过土壤表面。

12h～16h（过夜）后，从烧杯中取出过滤器。用湿布盖住过滤器，上面压玻璃板，使用抽水泵

吸掉未保留在土壤中的水，吸水10min±1min。

在104℃±1℃的烘箱中加热4h，并在干燥器中冷却，每次加热后称重，精确至1mg，将过滤器

中的含水饱和土壤干燥至恒定质量。当连续两次称量结果相差小于0.1％时，能被认为已达到恒定质量。

对于之前使用的土壤，可以使用之前确定的干燥时间，而无需检查是否达到了恒定质量。

对于每个过滤器，如示例所示，按土壤干重的百分率计算持水力，将结果修约至1％。计算3次测定

结果的平均值。

示例：

空过滤器11.325g

过滤器+新鲜土壤20.475g

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新鲜土壤9.150g

过滤器+浸过水的土壤