T-CPMA 031-2023 病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法 鼻病毒

Isolationandidentificationofpathogenicmicroorganisms—Humanrhinoviruses中华预防医学会发布I II 1 1 1 1 2 3 3 4 7 9 1病原微生物菌（毒）种分离和鉴定方法鼻病毒可在人宫颈癌细胞、人胚肺及二倍体细胞系或人胚气管器官培养中增殖。4缩略语NCR：非编码区(NoncodingRegion)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactioPS：青链霉素混合液100×(Penicillin-StreptomycinSolution)Q-PCR：荧光定量PCR(QuantitativeFluorescencTCID50：半数组织培养感染剂量(50%组织细胞感染量)(Fifty-percentTissueCultureInfectiveDose)2临床样本为呼吸道感染者的鼻咽拭子、支气管肺泡灌洗液、5.2.2可以在24h送达实验室的样本可以在4℃存储和运输。5.2.324h无法送达实验室的5.3临床样本前处理5.3.2.1若痰液中含有少量黏液，按照咽拭子样本的处理方法离心后接如支气管肺泡灌洗液、气管分泌物等的处理原则按5.6敏感细胞5.7病毒培养条件5.8病毒分离临床样本接种细胞，病毒分离成功时可见培养细胞出现明显CPE，表现为细胞肿胀、变圆、脱落36.1.1应对鼻病毒基因VP2/4和/或V6.1.2对测得的病毒基因序列进行序列比对，判断病毒的种和基鼻病毒具备小RNA病毒的形态学特征，无包膜、呈球形、直径约为4RV_5NCR_FNCRRV_5NCR_RRV_5NCR8.2.1.3用不含血清的DMEM培养基清洗细胞两遍，将上5当细胞出现CPE后，将细胞培养板置于-80℃冰箱和37℃水浴冻融两次，将细胞2000g离心10min，离心后的上清液分装选取合适大小的空斑下进行病毒的下一轮增6Reed-Muench计算公式TCID50＝高于50%死亡率的病毒稀释度的对数+距离比值×稀释倍数的对GGGACCAACTACTTTGGGTHRV-CFACTACTTTGGGTGTCCGTGTHRV-CR7接触样本，漂浮在样本上5min~10min，夹起分别以50%~70%~90%~100%~100%分别以1%醋酸双氧铀和0.2%枸橼酸铅染液进行染色，时间分别为109质量控制和生物安全要求89.1应制定病毒分离和鉴定等关键技术方法的标准操作程序，技术方法应经过至少两家独立实验室确9.3病毒应是纯培养物，无外源因子污染。9.4病毒的分离、培养、传代、滴度测定和鉴定等试验过程应记录并可溯源。9.5病毒分离、培养、滴度测定等操作应B.9水平电泳仪：包括电源、电泳槽、胶槽和梳）：[1]GB/T37864—2019生物样本库质量和能力通用要求[2]WS315—2010人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构设置技术规范[3]人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫科教发[2006[4]刘剑君,魏强．病原微生物保藏管理与技术手册[M].北京:北京大学医学出版社，2019Hum