发酵工程制药-脂类药物的发酵制药(生物制药工艺课件)

DHA的发酵制药名称：二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid）英文简称：DHA俗称：脑黄金分子式：C22H32O2结构式：

隶属：多不饱和脂肪酸ω-3系列DHA化学结构1、辅助脑细胞发育2、促进光感细胞的成熟3、抗过敏、增强免疫4、抗氧化、抗衰老5、降低血脂肪6、癌症的治疗DHA生理功效（1）生产工艺之鱼油DHA原料：金枪鱼和铿鱼油工艺流程：摘出眼窝脂肪煮沸抽提油层分离脱腊脱色脱臭精制DHA油取鱼头DHA生产工艺1、胆固醇含量高，带有鱼腥味2、受季节、捕捞时间等条件限制3、氢化处理工艺降低了DHA产量4、DHA含量低，含有大量其他脂肪酸，浓缩困难优点：缺点：1、价格便宜2、含有多种健脑成分生产藻类：隐藻、硅藻等海生异养微藻藻体收集冷冻干燥脂肪酸萃取脂肪酸转酯化分离纯化工艺流程：（2）生产工艺之微藻DHA1、生长繁殖快速，富集DHA2、提取工艺较为简单3、全年进行，不受季节和气候的影响4、微藻DHA无异味5、生产条件要求不高1、合成具有藻种的特异性2、微藻生长生产受光照、温度、溶氧量、盐度、pH值等3、培养周期、培养密度、保存方式也对微藻生产DHA有影响优点：

缺点：鱼油DHA微藻DHA从深海鱼油中提取从海洋微藻中萃取DHA含量低，12%DHA含量高，≥35%DHA乙酯乙酯型DHA不稳定且生物利用率低天然的甘油三酯型，较稳定，生物利用度高潜在海洋污染（重金属、有机污染物）不含海洋污染物鱼腥味重无鱼腥味破坏海洋生态平衡充分利用海洋生物资源 菌种：破囊壶菌和裂殖壶菌（3）生产工艺之真菌DHA工艺流程：1、可人为控制影响因素，保质保量2、分离浓缩简单，制备高纯度DHA。1、缺乏高产DHA的优质菌种2、处于实验室阶段，未能大规模工业化生产3、从发酵液中提取DHA的方法不适宜适应于工业化生产4、微生物可利用的底物较贵，生产成本高

优点：

缺点：1、分子蒸馏法：利用混合物组分挥发度的不同而得到分离2、低温分级法：利用低温下混合物组分在有机溶剂中溶解度不同来进行分离3、溶剂提取法：利用脂肪酸盐在某种有机溶剂中的差异来分离浓缩DHA提取工艺之各种方法4、尿素包合法：利用脂肪酸与尿素的结合能力不同5、超临界CO2萃取法：调节温度和压力使各组分在超临界CO2流体中的溶解度发生大幅度变化而达到分离6、酶法破碎法：利用酶反应分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁鱼油DHA（强弩之末）微藻DHA（如日中天）真菌DHA（后起之秀）应用前景之行业展望应用前景之行业展望由图可看出：1、增长速度快2、供大于需3、朝阳产业番茄红素的发酵制药目录番茄红素简介三孢布拉氏霉菌的发酵生产红酵母生产番茄红素存在问题植物黄金——番茄红素2024/6/5

番茄红素（Lycopene）是类胡萝卜素的一种，是一种很强的抗氧化剂，在清除人体“万病之源”――自由基方面，番茄红素的作用比β-胡萝卜素更强大。

2003年，美国《时代》杂志把番茄红素列在“对人类健康贡献最大的食品”之首，番茄红素也因此被称为“植物中的黄金”。

番茄红素是脂溶性色素，可溶于其他脂类和非极性溶剂中，不溶于水，难溶于强极性溶剂如甲醇、乙醇等，可溶于脂肪烃、芳香烃和氯代烃如乙烷、苯、氯仿等有机溶剂。

番茄红素（Lycopene）是一种很强的抗氧化剂，具有极强的清除自由基的能力，对防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌等有显著效果，有效抑制癌细胞的扩散和复制，还有预防心脑血管疾病、提高免疫力、保护细胞DNA免受自由基损害，防止细胞病变、突变、癌变；含强力抗氧化生物活物质，能促使细胞的生长和再生，美容袪皱，维持皮肤健康，延缓衰老等功效。它是自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化作用是β-胡萝卜素的2倍，VE的100倍。2024/6/5番茄红素功效番茄红素的结构在自然界中番茄红素主要以全反式结构存在。而全反式结构是一种具有11个碳碳共轭双键的非环状平面共轭多不饱和脂肪烃，因而它更易于被氧化。而抗氧化性是番茄红素一切功效的源泉。2024/6/5

1873年，Hartsen首次从番茄浆果中提取出来一种呈深红色的晶体1903年，Schunch将这种从番茄中提取到的物质正式命名为番茄红素。过去人们一直认为，只有那些具备β—紫罗酮环并能转化为维生素A的类胡萝卜素，如α—胡萝卜素、β—胡萝卜素等才与人类的营养和健康有关，而番茄红素因缺乏此结构，不具有维生素A的生理活性，故对此研究很少；但近几年的研究发现，番茄红素有比其他类胡萝卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成为目前国际上功能食品成分研究的一个热点。2024/6/5

对番茄红素的研究在2000年以前鲜有报道，近几年骤然升温，2009-2014年，与番茄红素有关的报道达1000多篇，内容包括：番茄红素的性质和提取方法；番茄红素及其研究进展；番茄红素的生产工艺研究进展等。近10年，仅在中国申请的有关番茄红素的国内外专利就多达几十份。2024/6/5

目前国外有日本、匈牙利、美国、俄罗斯的多家公司申请了关于番茄红素生产专利，但只有从鲜番茄中提取番茄红素的工艺在以色列LycoredNaturalProductsIndustriesLtd实现了商业化大规模的生产。而中国的番茄红素开发亦被纳入“国家863计划”，受到的高度重视。我国番茄红素的生产和研究均处于起步阶段。、上海的中国华源集团有限公司等有限几家企业，而华北制药是全国第一家采用生物发酵法提取番茄红素的企业。另据报道由江南大学和盐城市瑞智生物技术有限公司共同研制、开发的高科技产品天然番茄红素胶囊目前也已投入批量生产。

番茄红素的生产工艺2024/6/5生产方法优点缺点天然产物提取法天然、绿色、无毒原料来源有很大局限性，生产成本高，不能规模化生产化学合成法成本低，生产工艺简单溶剂和重金属残留量高，过量食用有毒副作用微生物发酵法天然、绿色、无溶剂残留、无重金属残留；生产成本低、工艺简单、周期短、产量高；体内吸收率高多集中在实验室规模，工业化生产的基础和应用研究还未跟进合成番茄红素的微生物

迄今研究发现，能够生产番茄红素的微生物包括能自身合成番茄红素的革兰氏阴性菌、真菌、藻类以及基因工程菌。2024/6/5三孢布拉氏霉菌

三孢布拉氏霉菌以其生长迅速、生物量高、产β-胡萝卜素能力强在发酵法生产番茄红素方面展现出较好的工业化应用前景，成为目前唯一能够实现工业化生产的一种高产丝状真菌。2024/6/5三孢布拉氏霉菌的发酵生产

目前三孢布拉霉的筛选多采用诱变育种和构建基因工程菌的方法。

诱变育种:

常规的物理和化学诱变方法有紫外、60Co、激光、亚硝基胍、硫酸二乙酯等。缺点：细胞很难表现出正突变效果,菌种的生产性状不稳定,番茄红素的产量低。

2024/6/51

菌种选育三孢布拉氏霉菌的发酵生产

1

菌种选育基因工程技术:

1990年Norihiko等报道在革兰氏阴性菌中发现了六个与类胡萝卜素合成有关的基因，分别是CrtE,CrtX,CrtY,CrtI,CrtB和CrtZ，其中CrtE,CrtI和CrtB与番茄红素的合成有关，其参与番茄红素的合成途径如下所示:

番茄红素FPPGGPP

八氢番茄红素CrtECrtICrtB基因工程技术:

构建基因工程菌的思路：在一些能够合成法尼基焦磷酸(FPP)的微生物中插入上述基因，使重组子能够合成类胡萝卜素。美国专利报道将控制番茄红素合成的基因crtE,crtB,crtI转入拟分枝孢镰刀菌,得到0.5mg/g细胞干重的番茄红素。Wang等[1]通过对红假单孢球菌(Rhodobactersphaeroides)中八氢番茄红素脱氢酶的基因crtI进行定点突变,使番茄红素的产率提高到90%。[1]WangCW，LiaoJC．AlterationofproductspecificityofRhodobactersphaeroidesphytoenedesaturasebydirectedevolution．TheJournalofBiologicalChemistry，2001，276(44)：4461～4464

利用基因工程技术实现了从实验室规模走向小规模产业化,但工程细胞携带的质粒对过程控制条件要求苛刻,易脱落,番茄红素产量大幅降低。在产业化过程中,研究者更多的倾向于选择天然生产菌种,如具有较高生产能力的三孢布拉氏霉菌,这样就可以避免发酵工程上游技术中容易遇到的问题。三孢布拉氏霉菌的发酵生产

2培养基

尽可能地利用成分简单且价格低廉的培养基向来是发酵工程的宗旨，尤其是利用生物质原材料，这就涉及到原材料的选择及处理问题。最佳发酵培养基配方如下:玉米淀粉4%;葡萄糖2.0%;黄豆饼粉1%;大豆分离蛋白3%;玉米浆2%;磷酸二氢钾0.1%;硫酸镁0.02%;VB10.5%;油5%;BHT0.05%;pH值为7.2。此配方比较稳定,平均色素值为1922mg/L。最终优化的中间补料工艺如下:48h补加葡萄糖1.0%,硫酸铵1.0%,磷酸二氢钾0.1%。此工艺比较稳定,平均色素值增加11%。2024/6/5

pH：发酵液初始pH7.5时利于番茄红素的积累,但发酵过程中控制恒定的pH7.5,对发酵极为不利。因为不调节pH时,菌体能产生多种有机酸作为碳源;而调节恒定的pH,影响代谢流向。温度：产生番茄红素的最佳温度为25℃,较高的温度(28℃~30℃)将会增加β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素的含量,降低番茄红素的产量。3pH、温度、搅拌速度和通气率搅拌速度：提高搅拌转速能够在一定程度上提高溶氧速率，但高搅拌转速形成的高剪切力，使得菌体受损，生物活性降低致使生物量减小，仅单纯加大通气量，在发酵处于对数生长期时，仍然达不到要求。通气率:增加空气流速,提高空气中的O2浓度,能够增加溶氧水平并降低CO2浓度,因此能促进番茄红素的合成。2pH、温度、搅拌速度和通气率

在低转速(150r/min)和高通气率(1.5vvm)时可以获得较高的胡萝卜素产量和生产率;在高转速(500r/min)和中等通气率下(1vvm),可以获得较高产率和菌体生物量。2pH、温度、搅拌速度和通气率2024/6/53发酵促进剂1.性激素——三孢酸以及结构类似物

三孢酸是一种激素，以β一胡萝卜素为前体合成，培养基中加入三孢酸可以提高番茄红素的产量。通过对三孢酸结构类似物结构式的分析，可以确定化合物必须具备1个环状结构并带1个酮基和1个侧链结构才具有这种生物活性。例如β-紫罗酮、脱落酸、异烟肼、琥珀酰亚胺、柠檬油萜烯和芳香族化合物的结构类似物也有此性质。2.氧载体与表面活性剂

三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，从发酵动力学方面去改善培养介质的性能，可以通过添加氧载体、表面活性剂来提高同一反应系统的传氧系数,从而提高番茄红素的产量。3.番茄红素环化酶抑制剂

生物法生产番茄红素的关键步骤就是添加番茄红素环化酶抑制剂，打断番茄红素至β一胡萝卜素的环化反应，使代谢流停留在番茄红素阶段。常见的番茄红素环化酶抑制剂有两类：叔胺类化合物：主要包括对二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基乙醇、2一二甲氨基一1一丙醇、1一二甲氨基一2一丙醇、3一二异丙基氨基一1一丙醇、1一二异丙基氨基一2一丙醇、三乙胺、2一二甲氨基乙苯等；但目前由于毒性较大，在微生物法生产番茄红素中较少应用。含氮类杂环化合物：如烟碱、咪唑、吡啶、吗啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物。4.麦角固醇合成抑制剂

番茄红素和麦角固醇的合成前体都是法尼基二磷酸(FPP)，通过控制麦角固醇的合成，来达到积累番茄红素的目的。麦角固醇合成抑制剂,如十二环吗啉、嗪氨灵、氟康唑、酮康唑、盐酸特比萘芬等，抑制合成麦角固醇酶的活性，使得麦角固醇产量降低，从而使类胡萝卜素产量提高。

三孢布拉霉NRRL2895(+)和NRRL2896(-)正、负菌株的比例、番茄红素环化酶抑制剂砒啶和肌酐、三孢酸结构类似物脱落酸、3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-COA)前体物亮氨酸以及甲羟戊酸