(高清版)GBT 41556-2022 牛巴贝斯虫病诊断技术

牛巴贝斯虫病诊断技术国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。1牛巴贝斯虫病诊断技术1范围本文件规定了牛巴贝斯虫(Babesiabovis)和双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)的检测技术及牛巴贝斯虫病的诊断技术要求。本文件适用于牛巴贝斯虫病病原检测、核酸检测、抗体检测及牛巴贝斯虫病的诊断。注：本文件所称牛巴贝斯虫病为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫单独或混合感染引起的牛的巴贝斯虫病。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)EB:溴化乙锭(Ethidiumbromide)ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)HRP:辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)IgG:免疫球蛋白G(ImmunoglobulinG)IPTG:异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)ITS:内转录间隔区(Internaltranscribedspacer)PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline)PBST:磷酸盐吐温缓冲液(PhosphatebufferedsalineTween)PCR:聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)RAP-1:棒状体相关蛋白-1(RhoptryassociaTAE:三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(Tris-acetate-EDTA)TMB:3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)25材料和试剂5.1试剂5.1.62×PremixTaq酶混合液(商品化)包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol5.1.12牛巴贝斯虫阳性基因组对照(用牛巴贝斯虫感染牛，染虫率达到5%以上时，采集抗凝血，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/μL;或序列合成基因片段(见附录B中B.1)作为阳性对照。5.1.13双芽巴贝斯虫阳性基因组对照(用双芽巴贝斯虫感染牛，染虫率达到5%以上时，采集抗凝血，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/μL;或序列合成基因片段(见B.2)作为阳性对照。5.1.14巴贝斯虫阴性基因组对照(筛选巴贝斯虫阴性牛，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/μL)。5.1.16辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛IgG抗体。5.1.17TMB底物溶液。5.2.2抗凝真空采血管。5.2.6各种规格的微量移液器吸头。5.2.796孔ELISA板。5.3.1光学显微镜(含100×物镜)。5.3.3核酸电泳系统。5.3.7离心机。35.3.8高压蒸汽灭菌器。5.3.9酶标仪。5.3.10恒温箱。5.3.11核酸蛋白检测仪。6生物安全要求样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应遵守GB19489和GB/T27401的相关规定。7临床诊断7.1典型临床症状7.1.1体温升高到40℃~42℃,呈稽留热型。7.1.2贫血，可视黏膜苍白或黄染(见附录C图C.1中①)。7.1.3血红蛋白尿，尿液呈棕红色至酱油色。7.1.4牛巴贝斯虫感染时，会表现较严重的神经症状。7.2典型病理变化7.2.1血液稀薄如水，凝固不良。7.2.2皮下组织、肌间结缔组织和脂肪呈胶样浸润黄染(见图C.1中②)。7.2.3皱胃和肠黏膜潮红并有点状出血。7.2.4实质性脏器肿大、出血、黄染或呈深棕色(见图C.1中③④⑤)。7.2.5膀胱膨大，贮存尿液深棕色(见图C.1中⑥)。7.3流行特点7.3.1患病动物有蜱叮咬史，该病主要发生在微小扇头蜱(微小牛蜱)(见附录D中图D.1)分布的区域。7.3.2一年之内可以暴发2～3次，多发生于4月～10月，呈散发。7.3.3两岁以内的犊牛多发；本地牛症状轻微，引进牛、纯种牛和改良牛常表现明显临床症状。7.4结果判定牛只出现7.1临床症状或剖检时有7.2病理变化，并符合7.3的流行特点，判为疑似牛巴贝斯虫病。8血涂片显微镜镜检8.1血涂片制备用剪毛剪剪去牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖，挤取一滴耳尖静脉血于载玻片上，用推片将血液推成薄8.2血涂片固定加甲醇于血涂片上进行固定，使甲醇完全覆盖血涂层，待晾干后重复一次。8.3血涂片染色在固定好的血涂片上滴加姬姆萨染色液工作液，使染色液完全覆盖血涂层。室温染色30min,用4自来水冲洗掉染色液，自然晾干或用吹风机吹干待检。8.4显微镜镜检在染色好的血涂片上滴加一滴香柏油，用光学显微镜在100×物镜下观察100个视野。8.5结果判定红细胞内观察到巴贝斯虫典型虫体(见附录E中图E.1和图E.2)时，判为血涂片显微镜镜检阳性。红细胞内未见典型虫体，但观察到少量点状、较大的圆形单个疑似虫体时，判为血涂片显微镜镜检疑似阳性。未出现8.5.1和8.5.2的结果，判为血涂片显微镜镜检阴性。9牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫PCR检测方法9.1样品处理采集牛静脉抗凝血于密闭塑料离心管中，编号，4℃保用商品化的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,方法按照试剂盒说明书。提取的DNA立刻进行PCR扩增或—20℃保存备用。9.3PCR反应操作方法用引物BoF/BoR和BbF/BbR,按照附录F中表F.1引物序列合成。配制PCR反应体系，按照附录G中表G.1配制，反应体系为25μL。牛巴贝斯虫阳性DNA为牛巴贝斯虫阳性基因组对照(5.1.12),双芽巴贝斯虫阳性DNA为双芽巴贝斯虫基因组对照(5.1.13),阴性对照为巴贝斯虫阴性牛血于200μLPCR管中配制反应体系，混匀，置PCR仪中进行扩增。扩增程序为：95℃预变性5min;然后92℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min,共扩增35个循环；72℃延伸10min。9.3.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳和成像用1×TAE缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶，取PCR产物10μL与2μL6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭或同类核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶制备的凝胶块中。在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳约30min,当溴酚蓝到达底部时停止电泳，凝胶成像分析系统观察结果，并拍照保存。5GB/T41556—20229.3.4质控标准9.3.4.1牛巴贝斯虫特异性引物扩增牛巴贝斯虫阳性DNA对照出现大小为408bp的特异性条带，且双芽巴贝斯虫阳性DNA和阴性对照无扩增条带时，判为试验成立(按附录H中图H.1)。9.3.4.2双芽巴贝斯虫特异性引物扩增双芽巴贝斯虫阳性DNA对照出现大小为646bp的特异性条带，且牛巴贝斯虫阳性DNA和巴贝斯虫阴性牛血液DNA对照无扩增条带时，判为试验成立(按图H.2)。9.4结果判定9.4.1.1牛巴贝斯虫核酸阳性用牛巴贝斯虫特异性引物自待检样品基因组DNA中扩增出大小为408bp的条带，且用双芽巴贝斯虫特异性引物未扩增出条带时，判定为牛巴贝斯虫核酸阳性(按图H.3)。9.4.1.2双芽巴贝斯虫核酸阳性用双芽巴贝斯虫特异性引物自待检样品基因组DNA中扩增出大小为646bp的条带，且用牛巴贝斯虫特异性引物未扩增出条带时，判定为双芽巴贝斯虫核酸阳性(按图H.4)。9.4.1.3牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸双阳性用牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫特异性引物从待检样品基因组DNA中分别扩增出大小为408bp和646bp的条带时，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸双阳性(按图H.5)。样品无特异性的阳性扩增条带出现，判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫核酸阴性。10牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫ELISA抗体检测方法10.1材料准备牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白-1(RAP-1)C端重组抗原按照附录I制备，巴贝斯虫标准阴性对照血清按照附录J制备，牛巴贝斯虫和双芽贝斯虫标准阳性对照血清按照附录K制备。其他相关试剂按照附录A配制。10.2待检血清样品的处理静脉无菌采集牛血液，不少于3mL。室温静置2h,待血液自然凝固后，于2℃~8℃冰箱中放置2h。4℃3000g离心10min,收集上清液，分装于1.5mL离心管，于—20℃冰箱保存或送检。10.3操作步骤10.3.1抗原包被用包被液将牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原分别稀释成质量浓度为2μg/mL6和1μg/mL,按100μL/孔加到96孔ELISA板中，分别包被ELISA板，用封板膜封口，置于4℃冰箱15h。翌日，去掉封板膜，甩掉孔内液体，每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次，每次1min,最后一次拍干。每孔加入新鲜配制的封闭液200μL,用封板膜封口，37℃孵育1h(双芽巴贝斯虫)或1.5h(牛巴贝斯虫)。去掉封板膜，甩掉孔内液体，同10.3.1中的方法洗涤，最后一次拍干。将10.2处理的血清样品用稀释液按1:20稀释，每孔加入100μL,设置2个重复。同时每张板上设标准阳性对照、标准阴性对照和空白(稀释液)对照各2孔，用封板膜封口，37℃孵育1h。去掉封板膜，甩掉孔内液体，同10.3.1中的方法洗涤，最后一次拍干。用稀释液将HRP标记的兔抗牛IgG抗体稀释至工作浓度，每孔加入100μL,用封板膜封口，37℃孵育1h。去掉封板膜，甩掉孔内液体，同10.3.1中的方法洗涤，最后一次拍干。每孔加入100μL的终止液，终止反应。混匀后立刻在酶标仪上读取OD₄5o值。标准阳性对照血清平均OD₄s₀值>1.0,且标准阴性对照血清平均OD₄s值<0.4时，试验结果成立。按下式计算S/P值：10.5.2.1牛巴贝斯虫血清抗体阳性用牛巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测，待检样品S/P值≥0.28时，判定为牛巴贝斯虫血清抗体阳性。10.5.2.2双芽巴贝斯虫血清抗体阳性用双芽巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测，待检样品S/P值≥0.32时，判定为双芽巴贝斯虫血清抗体阳性。10.5.2.3牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体双阳性用牛巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测时待检样品S/P值≥0.28,且用双芽7GB/T41556—2022巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测时待检样品S/P值≥0.32,判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体双阳性。用牛巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测时待检样品S/P值<0.28,且用双芽巴贝斯虫RAP-1的C端重组抗原包被的ELISA板检测时待检样品S/P值<0.28,判定为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫血清抗体阴性。11综合判定11.1阳性出现7.4疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：a)出现8.5.1结果的，判为牛巴贝斯虫病阳性；b)出现9.4.1.1或10.5.2.1结果的，判为牛巴贝斯虫感染引起的牛巴贝斯虫病阳性；c)出现9.4.1.2或10.5.2.2结果的，判为双芽巴贝斯虫感染引起的牛巴贝斯虫病阳性；d)出现9.4.1.3或10.5.2.3结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫混合感染引起的牛巴贝斯虫病阳性。11.2隐性感染未出现7.4疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：a)出现8.5.1结果的，判为牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫隐性感染；b)出现9.4.1.1或10.5.2.1结果的，判为牛巴贝斯虫隐性感染；c)出现9.4.1.2或10.5.2.2结果的，判为双芽巴贝斯虫隐性感染；d)出现9.4.1.3或10.5.2.3结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫隐性混合感染。未出现7.4疑似巴贝斯虫病特征，进一步判定如下：a)出现8.5.2、9.4.2和10.5.3结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染阴性，即牛巴贝斯虫病阴性；b)出现8.5.3、9.4.2和10.5.3结果的，判为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染阴性，即牛巴贝斯虫病阴性。8(规范性)标准中涉及的试剂配制方法A.1姬姆萨染色液原液准备33mL甘油。将0.5g姬姆萨染料置于研钵中，加少量甘油进行充分研磨，然后加入全部的甘油，55℃~60℃水浴加热1h～2h,期间不断摇动混匀。冷却至室温后加入33mL甲醇，搅拌混匀，储存在棕色瓶中室温静置6～12个月，过滤备用。A.2姬姆萨染色液工作液按每毫升去离子水加200μL姬姆萨染色液原液进行配制。A.3TAE缓冲液的配制冰醋酸57.1mLTris-Base用约800mL灭菌去离子水溶解，充分混匀后用灭菌去离子水补齐至1000mL,常温保存备用。A.3.21×TAE使用液50×TAE贮存液10mL去离子水490mLA.410mg/mL溴化乙锭称取溴化乙锭1g,加去离子水定容至100mL,磁力搅拌充分溶解后，转移至棕色瓶内室温避光保存。A.51.5%的琼脂糖凝胶1×TAE使用液100mL微波炉加热至琼脂糖熔化，待稍冷却后加入终浓度为0.5μg/mL溴化乙锭或同类核酸染料，摇匀。去离子水900mL完全溶解后，调pH值至9.6,加去离子水至1000mL,用0.45μm的一次性针头滤器过滤除菌，室温保存备用。9A.7稀释液(pH7.4,PBS)NaCl40gNa₂HPO₄·12H₂O完全溶解后，调pH值至7.4,加去离子水至5L,混匀，常温保存备用。PBS(pH7.4)999.5mL吐温-200.5mLA.9封闭液脱脂奶粉5gA.10终止液(2mol/LH₂SO₄)去离子水88.9mL将浓H₂SO₄缓慢加入到去离子水中，混匀，冷却至室温。(资料性)牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫PCR扩增片段核酸序列B.1牛巴贝斯虫内转录间隔区(ITS)目的基因片段序列CTTGCGGCGATTTGGCAACGCCGGCTACCCTAGTAGCCGGTTGGGGCTCCGCCCCCGTTGCTCCCCACCCCGAGGGCCGTGACTGCCACGACCCGGGTTAAGCTCGCCTCGGCGAGATGCACCCCCTTCTTGGGGGTGCCCCTCCAGCCCTTTAGGGCTGGCACAACTACACACCACACACTTACACTACTTCAACTCCCAGCGATGGATGCCTCGGCTCGCGCCTCGATGAAGGACGCAGCAAAGTGCGATATCCAGCATGATTIGCAACTICTIGCGATIGCTAGACCTCTGAACGTAACCAACACACTTTTIGTACGICCATCTCAGTGAATTTCCATTATGGTGTGACACACCACTAGTGTGTGTTGCACCGCCTTGGCGGTGCCTCTACACCGCTCCTTCACGB.2双芽巴贝斯虫内转录间隔区(ITS)目的基因片段序列GCGTTGTCGTCGCTCTTGCGGCGTGCTCTGCGAGCGGGTTCCGCCCCCGTCCGTCGCTAGCATGTCGCGGTTTATTGCCGTGTCGTCTGGCAGCGGTCGGGGGATGTCGCTGCGCCGTGTGTGCGAGCGACCGCCGTGTCTCAGCGTTGCTGTGTCTCGGCTGCCTTTTGGTTGTTGCAACTCCGCGCTTTTTGGCGTCTTTGTAAACTTTAAACTTCCAGCGATGGATGTCTTGGCTCACACAACGATGAAGGACGCAGCGAATIGCGATACGCAGTATGACTTGCAGACTICTGCGATTTACCAGACCTCTGAACGTAACAAACACACCGCCTCTGCTCGCACGCGGTACTCCCGTTTCAGTGAGCCCCCAATCCTGAGGCCCCGGCCCATTTATAACGGCTACTGAGTGCTCTAATGCGTTTCAGCTGCTGCTTTGAATGTGTCCGTGCTCCTCGCGAGTGGGCGTCGCCTTGTCGCCCTAATTTCTGTGAACGCTTGCGCGGCTTTGGCCCTGCACGTGTIGGAGCGCCTGCTGTAGTTICTACTCACTTTCGCTCCTGTCGCGGTGCTGCGCTTGGTGTTTTGCGGCTGGGCCGTCTCTTTTTGCTCCTGAGATCGGGTGAGGCCATCCGCCGAATTTAAG(资料性)牛巴贝斯虫病典型病理变化牛巴贝斯虫病典型病理变化见图C.1。标引序号说明：①——可视黏膜黄染；②——皮下组织、肌间结缔组织和脂肪组织黄染；④——脾脏肿大；⑤——肾脏深棕色；⑥——膀胱内尿液呈深棕色。图C.1牛巴贝斯虫病典型病理变化图(资料性)牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫传播媒介微小扇头蜱(微小牛蜱)鉴定特征D.1鉴定要点雌蜱：体型小。假头基六角形。须肢粗短，第Ⅱ、Ⅲ节有横脊。盾板显著长胜于宽，后侧缘微波状，后角窄钝；无刻点。无缘沟及缘垛。基节I亚三角形，内外距均粗短而圆钝。气门板长圆形。雄蜱：体型小。假头基六角形。须肢粗短，第Ⅱ、Ⅲ节有横脊。无侧沟和缘垛；尾突明显，末端尖细。具肛侧板和副肛侧板，无肛下板。气门板长圆形。D.2微小扇头蜱雌蜱和雄蜱形态微小扇头蜱雌蜱和雄蜱的形态特征见图D.1。113标引序号说明：①——雌蜱背面；②——雄蜱背面；③——雌蜱假头背面；④——雄蜱假头背面。图D.1微小扇头蜱雌蜱和雄蜱形态图(资料性)牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫典型虫体形态E.1红细胞内的牛巴贝斯虫形态牛红细胞内的牛巴贝斯虫典型虫体形态见图E.1,箭头所示为红细胞内典型的牛巴贝斯虫双梨籽形虫体形态。图E.1红细胞内的牛巴贝斯虫典型形态图(姬姆萨染色)E.2红细胞内的双芽巴贝斯虫形态牛红细胞内的双芽巴贝斯虫典型虫体形态见图E.2,箭头所示为红细胞内典型的双芽巴贝斯虫双梨籽形虫体形态。图E.2红细胞内的双芽巴贝斯虫典型形态图(姬姆萨染色)GB/T41556—2022(规范性)牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫内转录间隔区(ITS)特异性引物序列采用PCR方法开展牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫检测时，需合成其对应的引物对见表F.1。表F.1牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫ITS特异性引物序列引物名称引物序列扩增长度5'-CTTGCGGCGATTTGGC-3'5'-CGTGAAGGAGCGGTGTAGAG-3'5'-GCGTTGTCGTCGCTCTTG-3'5'-CTTAAATTCGGCGGATGG-3'BoR——牛巴贝斯虫反向引物；BbF——双芽巴贝斯虫正向引物；BbR——双芽巴贝斯虫反向引物。(规范性)PCR反应体系配制及注意事项G.1反应体系配制每个PCR反应体系包括的组分见表G.1。组成成分加样体积/μL总体积/μL2×PremixTaq酶BoF或BbF20μmol/LBoR或BbR20μmol/LDNA2无DNase/RNase水G.2注意事项G.2.1在配制PCR反应体系过程中，阳性对照DNA与待检样品DNA应在不同区域添加，以免造成污染。G.2.2所有试剂应按要求分别在4℃或—20℃条件保存。使用时室温融化，放置于冰上。GB/T41556—2022(规范性)PCR检测质控标准与结果判定图H.1牛巴贝斯虫特异性引物扩增质控标准用牛巴贝斯虫特异性引物，仅可自牛巴贝斯虫阳性基因组中扩增出大小约408bp的片段(见图H.1)。标引序号说明：1——牛巴贝斯虫阳性基因组对照；2——双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；3——巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照。图H.1牛巴贝斯虫特异性引物扩增质控标准图H.2双芽巴贝斯虫特异性引物扩增质控标准用双芽巴贝斯虫特异性引物，仅自双芽巴贝斯虫阳性基因组中扩增出大小约646bp的片段(见图H.2)。标引序号说明：1——双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；2——牛巴贝斯虫阳性基因组对照；3——巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照。图H.2双芽巴贝斯虫特异性引物扩增质控标准图GB/T41556—2022H.3牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫特异性引物检测结果用牛巴贝斯虫特异性引物，自待检样品基因组中扩增出大小约408bp的片段(见图H.3)。-408bp标引序号说明：M——核酸分子Marker;1——牛巴贝斯虫阳性基因组对照；2——双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；3——待检样品；4——巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照。图H.3牛巴贝斯虫特异性引物检测的阳性样品结果图用双芽巴贝斯虫特异性引物，自待检样品基因组中扩增出大小约646bp的片段(见图H.4)。1000hp标引序号说明：M——核酸分子Marker;1——双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；2——牛巴贝斯虫阳性基因组对照；3——待检样品；4——巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照。图H.4双芽巴贝斯虫特异性引物检测的阳性样品结果图用牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫特异性引物，自待检样品基因组中分别扩增出大小约408bp和646bp的片段(见图H.5).标引序号说明：1——双芽巴贝斯虫特异性引物扩增双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；2——双芽巴贝斯虫特异性引物扩增牛巴贝斯虫阳性基因组对照；3——双芽巴贝斯虫特异性引物扩增待检样品；4——双芽巴贝斯虫特异性引物扩增巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照；5——牛巴贝斯虫特异性引物扩增牛巴贝斯虫阳性基因组对照；6——牛巴贝斯虫特异性引物扩增双芽巴贝斯虫阳性基因组对照；7——牛巴贝斯虫特异性引物扩增待检样品；8——牛巴贝斯虫特异性引物扩增巴贝斯虫阴性牛血液基因组对照。图H.5牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫特异性引物检测的双阳性样品结果图(规范性)牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1重组抗原的制备I.1器械与设备引物BoRAP-F/BoRAP-R和BbRAP-F/BbRAP-R(20μmol/L),BamHI、X粒，感受态大肠杆菌BL21,卡那霉素，氨苄青霉素，异丙基-βD-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),His标签蛋白纯化试剂盒，GST标签蛋白纯化试剂盒，LB培养基，一次性针头滤器(孔径0.45μm),蛋白浓缩管。BoRAP-F:5'-TATCATATGCATCATCACCACCATCAC-3'BoRAP-R:5'-TATAAGCTTTCATTATTCCAGCAGATAACCT-3'BbRAP-F:5'-TATGGATCCAGCGTCGTTCCGAT-3'BbRAP-R:5'-TATCTCGAGTCATTACAGACCCCA-3'BoRAP-F/BoRAP-R引物对扩增牛巴贝斯虫RAP-1基因大小为825bp的片段(见附录L中L.1),5'端NdeI限制性内切酶位点和3个保护性碱基，3'端HindⅢ限制性内切酶位点和3个保护性碱基；BbRAP-F/BbRAP-R引物对扩增双芽巴贝斯虫RAP-1基因大小为435bp的片段(见L.2),5'端BamHI限制性内切酶位点和3个保护性碱基，3'端XhoI限制性内切酶位点和3个保护性碱基。I.4表达载体构建和鉴定引物用BoRAP-F/BoRAP-R或BbRAP-F/BbRAP-R,DNA模板用牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫标准阳性基因组DNA,反应体系为50μL,加样比例见附录G。反应条件为95℃预变性3min,然后95℃变性1min、58℃或62℃退火1min、72℃延伸1min,扩增30个循环，72℃延伸7min。扩增结束后，用商品化琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收合适大小的PCR产物。I.4.2双酶切用30μL酶切体系：I.4.1回收的23μL牛巴贝斯虫RAP-1基因PCR产物或pET-30a质粒，10×酶BamHI和XhoI双酶切I.4.1回收的双芽巴贝斯虫RAP-1基因PCR产物和质粒pGEX4T-1,并回收酶切产物。用10μL连接体系：1.4.2酶切回收的牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫RAP-1基因片段6μL,双酶切回收的质粒pET-30a或pGEX4T-1片段2μL,T4DNA连接酶1μL,10×连接缓冲液1μL,16℃水浴连接16h;将连接产物转化到感受态大肠杆菌BL21,操作步骤根据说明书进行。将I.4.3筛选的阳性菌液送相关公司测序，测序结果正确的菌株菌液用于重组抗原表达。I.5蛋白表达和纯化I.5.1取I.4.4牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫RAP-1阳性菌株菌液，按1:100的比例接种到含50μg/mL卡那霉素或100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min振荡培养至菌液ODoo值为0.6～0.8。加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,15℃振荡培养16h。1.5.2将诱导培养的菌液分装到250mL离心管中，在4℃下4000g离心10min,弃上清液。沉淀用含0.5mmol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl(pH8.0)悬浮到50mL离心管中，同前离心，弃上清液。I.5.3沉淀用15mL含0.5mmol/LNaCl和1mg/mL溶菌酶的20mmol/LTris-HCl(pH7.6)重悬，4℃过夜。将离心管垂直置于碎冰中，用超声细胞破碎仪按超声5s间隔5s的程序，超声破碎1.5.4于I.5.3超声破碎的菌体裂解物中，加入终浓度为1%的Triton-100助溶，在4℃以10000g离心10min,取上清液用0.45μm滤器过滤。滤过液用His(纯化重组的牛巴贝斯虫RAP-1)或GST(纯化重组的双芽巴贝斯虫RAP-1)标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白。I.5.5将纯化后的蛋白溶液装入处理好的透析袋中，用5mmol/LTris-HCl(pH8.0)在4℃透析4h~5h,重复该透析步骤3次。I.5.6将透析后的蛋白转入蛋白浓缩管，于4℃3000g～3500g离心，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，待浓缩管中蛋白浓度大于1mg/mL时停止离心。I.5.7浓缩的重组蛋白分装于1.5mL离心管，每支1.0mL,置于一40℃保存。(规范性)巴贝斯虫标准阴性对照血清的制备J.1实验动物选择于无巴贝斯虫病流行的地区，选取3～6月龄的健康黄牛，按照第8章和第9章的要求进行血涂片检查和PCR检测，两种方法均为阴性时符合要求。J.2巴贝斯虫血清抗体检测采集符合J.1要求牛静脉血5mL,分离血清。以附录I制备的牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1重组蛋白为抗原包被96孔ELISA板，检测血清中的抗RAP-1的抗体。当被检血清ODs值<0.35时符合要求。J.3标准阴性血清的收集将符合J.2要求的牛颈动脉放血至死亡，无菌收集全部血液，或采集需要量的静脉血，分离血清。该血清即为标准阴性对照血清，分装于不同规格的血清瓶或离心管，置于一40℃冰箱保存备用。(规范性)标准阳性对照血清的制备K.1实验牛选择选择符合J.1和J.2要求的两头黄牛，用于制备牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫标准阳性对照血清。K.2牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫感染两头牛分别静脉接种5.1.12和5.1.13的牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫抗凝血50mL。K.3抗体检测接种后每隔7d采集5mL静脉血，分离血清。以附录I制备的牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫RAP-1重组抗原包被96孔ELISA板，1:20稀释血清，检测K.2分离的感染前血清和感染后血清中的牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫抗体。感染后血清OD₄so>1.3,且感染后血清OD₄so/感染前血清OD₄so>4时符合要求。K.4标准阳性血清收集将符合K.3要求的牛颈动脉放血至死亡，无菌收集全部血液，或采集需要量的静脉血，分离血清。该血清即为牛巴贝斯虫或双芽巴贝斯虫标准阳性对照血清，分装于不同规格的血清瓶或离心管，置于一40℃冰箱保存备用。(资料性)用于重组抗原制备的牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫RAP-1基因片段核酸序列L.1表达牛巴贝斯虫RAP-1蛋白C端的基因片段序列CATCATCACCACCATCACCGCTGGATCAAAAAATTCCGCGACTTCTTCAGCAAAAACGTCACCCAGCCGACCAAAAAATTCATCGAGGACACCAACGAGGTCACCAAAAACTACCTGAAAGCGAACGTTGCGGAACCGACCAAAAAATTCATGCAGGACACCCACGAGAAAACCAAAGGCTATCTGAAAGAGAACGTCGCAGAACCGACCAAAACCTTCTTCAAAGAAGCGCCGCAGGTCACCAAACAC