转基因果蝇的杂交重组和鉴定

转基因果蝇的杂交重组和鉴定生06郑华2010030065同组成员：刘紫薇潘周娴贺佳琳王宇宁实验日期：2012年4月4日至5月27日实验目的：把插入在同一个染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果蝇中）通过重组交换整合到同一品系果蝇的同一染色体上，并得到可以稳定保存的品系（balanced或homozygous）。实验原理图1.常用的带P转座子载体示意图转基因果蝇（transgenicfly）是将带有目的基因的质粒通过显微注射转入白眼果蝇卵中，这些质粒上一般带有P转座子序列（PelementsaretransposablepiecesofDNAthatrandomlyinsertthemselvesintogenomicDNA），使得目的基因可以插入到果蝇染色体中。一般使用白眼果蝇的卵进行显微注射，质粒上带有的mini-white基因（红眼）可以作为转基因成功的标记（marker），带有目的基因的果蝇将成为红眼果蝇。mini-white的表达量决定了果蝇眼睛红色的深浅，这与目的基因插入位置和copy数目有关图1.常用的带P转座子载体示意图有基因A的转基因果蝇系tA和基因B的转基因果蝇系tB，A和B分别插在tA和tB的三号染色体上（t表示transgenic）。带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。另外，还需要应用到一个UAS-Gal4系统的神经细胞的driver，为GMR-Gal4，进行重组成功的鉴定。GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接,建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。在杂交后代中,特异性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。图图2.果蝇中GAL4/UAS系统(DanielStJohnston,2002)实验材料转基因果蝇A、B/Ser(翅膀缺刻)、+/Sbbalancer（白眼，平衡子Sb，短刚毛）的果蝇以及GMR-Gal4果蝇。其中，tA果蝇系为纯合体，转入Tau基因，该转基因与GMR-Gal4果蝇系进行杂交，其在GMR-Gal4的驱动下，产生子代的成体果蝇眼睛缺陷，表现为发育不全。tB果蝇系为纯合致死，带有一个Serrate（翅膀缺刻）的balancer，其自身带有GFP基因，能自发绿色荧光，在荧光显微镜下可观察。本实验中可能用到的balancer为：染色体Balancer显性表型标记（dominantphenotypicmarker）纯合（homozygous）3TM3Sb（短刚毛）致死（lethal）3TM3Serrate（翅膀缺刻）致死（lethal）实验方案因为要使A基因和B基因在同一条染色体上，又要稳定遗传，保证自由重组或者交叉互换都不会带来变异，因此目标蝇应含纯和致死的平衡子，即为AB/Sb或者AB/Ser。我们选择的是得到AB/Sb。其自交结果如下，可以保证自交稳定。ABSbABB纯和致死AB/Sb,保持性状稳定SbAB/Sb,保持性状稳定Sb纯和致死我们小组采用了两套方案，第一套方案和多数其他小组差不多，风险较小，但实验时间较长；方案二比方案一少杂交一代，但是得到所需要的目标蝇在杂交后代中的概率更小，需要更多的杂交后代以保证能够跳出目标果蝇。两种方案具体如下：未加注明的性状默认为野生型。其中蓝色的字是实际操作时使用的果蝇数目和日期。方案一P：13只A/A♀× 6只B/ser(残翅)♂（4月10日22:00）↓此处挑选非残翅处女蝇。F1:,A/B（非残翅），A/ser(此处挑选非残翅处女蝇。F1:11只A/B♀ × 5只+/Sb♂(短刚毛) （4月23日23:00）↓F2:ABAB++A/+红眼B/+(红眼绿色荧光)AB/+(红眼绿色荧光)+/+(白眼)SbA/Sb(红眼短刚毛)B/Sb(红眼绿色荧光短刚毛)AB/Sb(红眼绿色荧光短刚毛)+/Sb(白眼短刚毛)此处挑选红眼短刚毛的雄性。因为该步骤需要将红眼短刚毛的果蝇挑出，一个一个分离出来与GMR-GAL4/GMR-GAL4杂交，已验证其是否含有A基因。而如果一个瓶子里雌果蝇只有一只，产卵量较少，卵不易孵化，因此此处选择的红眼短刚毛果蝇应为雄性。因为用紫外线照射检验荧光可能会影响雄蝇的生殖能力，故在对B基因的检测放在对A基因检测的后面。出于同样原因，在GMR-GAL4/GMR-GAL4雌蝇产卵之后，将雄蝇先转移出来和+/Sb雌蝇杂交，待+/Sb也产卵以后，再检验F2雄蝇的荧光。如果F2雄蝇没有荧光，或者F3不显示出眼睛发育不全，则已经和+/Sb杂交上的蝇可以丢弃。由于A基因必须要在成蝇孵出5至6天以后才能观测到眼睛发育不全，因此要在雄蝇和Sb蝇进行杂交之前进行。F2:每只A/Sb,+/+♂ 或 B/Sb,+/+♂ 或 AB/Sb,+/+♂ × 1到4只+/+,GMR-Gal4/GMR-Gal4♀↓F3:A,+B,+AB,+Sb,++,GMR-Gal4A/+,+/GMR-Gal4(红残眼)B/+,+/GMR-Gal4(红眼绿色荧光)AB/+,+/GMR-Gal4(红残眼绿色荧光)Sb/+,+/GMR-Gal4(白眼短刚毛)如果得到了红残眼果蝇子代，则说明其父本有A基因。F2:AB/Sb,+/+♂× 2到3只+/Sb♀SbAB+Sb/+(白眼短刚毛)AB/+(红眼)SbSb/Sb死亡AB/Sb(红眼短刚毛)挑选红眼短刚毛果蝇为所需果蝇方案二我们考虑到如果让两个杂交同时进行，则可以缩短杂交代数，特别是最后一步验证A基因和与Sb杂交传代不能同时进行，因此我们就想让GMR-GAL4和Sb蝇进行杂交，这样F1代的红眼短刚毛雄蝇只需要一次杂交就可以同时完成与Sb雌蝇传代和与GMR杂交做A基因检验的目的，节省时间。另一个好处是不需要一只一只地进行杂交，操作要比方案一简便许多，所需培养基也少，甚至得到F2后都不用分雌雄，在看荧光之前可以放在原瓶中任其乱交，这对于本次试验中有一段关键时期培养基极度匮乏的情况来说颇为有利。并且该方案只需要在一开始使用GMR-GAL4果蝇，后面不再需要，对于本次试验中长期没有GMR-GAL的情况来说也很有优势，不过在GMR蝇很少的情况下，方案二一开始就用掉了GMR蝇，对GMR蝇保种不利。因此在5月1日至5月16日，我们主要把希望寄托于方案二。但是相对于方案一来说，在F2中挑到目标蝇（发育不全红眼短刚毛）的概率变为原来的0.5倍，但是由于此种方案下雌蝇和雄蝇都是可以的，因此得到目标蝇的大致概率一样的。总体上来讲，相对于方案一不确定性要更高一些，需要更多的果蝇才能保证结果。然而由于本次实验中培养基严重不足，在F2孵出之后没有瓶子分雌雄，长期未转瓶，导致实际上还是只能使用雄蝇。详细方案见下。P：A/A♀×B/ser♂（4月10日23:00） P’：+/Sb,+/+♀ ×5只+/+,GMR-Gal4/GMR-Gal4♂（4月12日23:00）↓ ↓F1:A/ser(残翅),A/B（非残翅） F1’:+/+,+/GMR-Gal4(非短刚毛)；+/Sb,+/GMR-Gal4(短刚毛)↓ ↓F1×F1’:5只A/B,+/+♀ × 5只+/sb,+/GMR-Gal4♂（4月23日23:15）↓F2:F1’\F1A,+B,+AB,++,++,+A/+,+/+（无明显性状）B/+,+/+（绿色荧光）AB/+,+/+（绿色荧光）+/+,+/+（无明显性状）+,GMR-Gal4A/+,+/GMR-Gal4（眼睛缺陷）B/+,+/GMR-Gal4（绿色荧光）AB/+,+/GMR-Gal4（绿色荧光，眼睛缺陷）+/+,+/GMR-Gal4（无明显性状）Sb,+A/Sb,+/+（短刚毛）B/Sb,+/+（绿色荧光，短刚毛）AB/Sb,+/+（绿色荧光，短刚毛）+/Sb,+/+（短刚毛）Sb,GMR-Gal4A/Sb,+/GMR-Gal4（眼睛缺陷，短刚毛）B/Sb,+/GMR-Gal4（绿色荧光，短刚毛）AB/Sb,+/GMR-Gal4（眼睛缺陷，绿色荧光，短刚毛）+/Sb,+/GMR-Gal4（短刚毛）如果这一步就有雄蝇又有雌蝇符合挑选标准，就完成实验，如果只有雄蝇或者只有雌蝇，则为了传代还需要在进行一代杂交。如下所示，F2:AB/Sb,+/GMR-Gal4×+/Sb,+/+↓F3:AB,+Sb,+AB,GMR-Gal4Sb,GMR-Gal4+,+AB/+,+/+(绿色荧光)+/Sb,+/+(短刚毛)AB/+,+/GMR-Gal4(残眼绿色荧光)+/Sb,+/GMR-Gal4(短刚毛)Sb,+AB/Sb,+/+(绿色荧光短刚毛)Sb/Sb,+/+(致死)AB/Sb,+/GMR-Gal4(眼睛缺陷，绿色荧光，短刚毛)Sb/Sb,+/GMR-Gal4(致死)实验结果实验的第一阶段本次实验大致可以分成两个阶段，第一阶段为到F2孵出成虫之前，这一阶段其他基本顺利，除了有P：A/A×B/ser的F1子代中有大量黄眼，白眼的异常现象4月7日拿到目标亲本4月10日P：A/A×B/ser(残翅)开始杂交4月12日方案二P’：+/Sb,+/+×+/+,GMR-Gal4/GMR-Gal4开始杂交4月21日方案一F1:A/B♀ ×+/Sb♂(短刚毛)开始杂交，4月23日又杂交了一瓶4月23日方案二：5只A/B,+/+♀ × 5只+/sb,+/GMR-Gal4♂4月30日方案一的F2成虫孵出。5月3日方案二的F2成虫孵出。本次试验中，我们是同时进行两个实验，比其他组需要更多的培养基和GMR-GAL4果蝇，因此如何平衡这两个方案对培养基和GMR-GAL4果蝇的需求就成为了问题。由于班级人数较多，培养基消耗速度很快且多次有问题，培养基长期短缺；GMR-GAL4蝇在挑出的5只雄蝇用于方案二后，基本没有出蝇，雌蝇只有2只成功孵化，没有完成自交传代，而其他做第三个实验的组的GMR-GAL4果蝇都在孵出少量成虫死尽。这两点原因大大影响了我们的实验的进度，特别是方案一，没有培养基和GMR-GAL导致挑出的F2雄蝇长期无法交配，方案一的停滞了很长时间，一直到5月10日才等到了GMR-GAL4果蝇与之杂交，此时F2已经孵出11天，生活力和繁殖力已经下降；而方案二不需要对雄蝇进行一只一只的操作，基本上不需要新培养基来，因此从五一假期之后我们基本上把注意力放在方案二上，在较长的时间里方案一基本放弃，处于停滞状态。直到方案二因为各种原因（见后）被认为成功的可能性不大以后，又在5月1