SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

实验SDS测定蛋白质

相对分子质量

电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中的泳动。许多生物分子如氨基酸、蛋白质、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。影响带电粒子在电场中泳动的因素1．生物大分子的性质：待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显影响。2．缓冲液：缓冲液pH值直接影响生物大分子的解离程度和带电性质。溶液pH值距离等电点愈远，生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时，生物大分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。3．电场强度：电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度。4．电渗：液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。5．支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。电泳技术的分类1．根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳：①自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。②区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉等。2．根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳：①高压电泳使用的电压在500～1000V，这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。②常压电泳使用的电压在500V以下，电位梯度为2～10V/cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。3．根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续pＨ电泳：①连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变。②不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳。4．根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。

5．根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。6．根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等。丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1～100μg）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶。可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺（Acr）与交联剂甲撑双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，经过聚合交联形成的三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种：（1）化学聚合：通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在TEMED催化下，过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、活化形成自由基丙烯酰胺，从而引发聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黄素作催化剂，核黄素在光照下光解成无色基，后者再被氧化成自由基而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定。化学聚合的凝胶孔径较小，且各次制备的重复性好。故一般采用化学聚合。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。浓缩效应在浓缩胶中进行；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。丙烯酰胺凝胶电泳还可结合十二烷基硫酸钠（SDS）以测定蛋白质亚基的相对分子质量。SDS是一种阴离子型去污剂，在蛋白质溶解液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的非共价键（氢键、疏水键）打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数。【操作步骤】一、安装垂直板型电泳装置查漏二、凝胶的制备

分离胶的制备在一个干净的小烧杯中，按所列的试剂用量配制。

SDS-不连续系统12％分离胶浓度，10ml体积配制量：1.30%凝胶贮液4.0ml2.分离胶缓冲液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%过硫酸胺0.07ml（冬天）（0.05ml）6.2%TEMED0.6ml浓缩胶的制备在另一个干净的小烧杯中。

4.5％分离胶浓度，5ml体积配制用量表：1.30%凝胶贮液0.75mL2.浓缩胶缓冲液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%过硫酸胺0.05mL（冬天）（0.03mL）

2%TEMED

0.3mL样品10μL样品15μL蛋白marker15μL样品15μL样品10μL两块胶一个电泳系统，两组共用：第一块胶第一组加样第二组加样牛血清15μL样品15μL蛋白marker15μL样品15μL牛血清15μL两块胶一个电泳系统，两组共用：第二块胶第一组加样第二组加样三加样将pH8.3的电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中，应没过短玻璃片。用微量注射器依次在各个样品凹槽内加样，一般加样体积为10～15μL。如样品较稀，可加20～30μL。由于样品溶解液中含有比重较大的甘油，故样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。四电泳将上槽接负极，下槽接正极。打开电源，开始时将电压恒压60V，待样品进入分离胶后，120V。蓝色染料迁移至下端约1～1.5cm时，停止电泳，约需1～2小时。

五剥胶取下凝胶模子，将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内。六染色和脱色

染色用一块胶，另一块胶用于转膜。加入染色液，染色45分钟。脱色

染色完毕，倾出染色液，加入脱色液。20～30min换一次脱色液，2～3次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清晰。七Mr的计算通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁移率的计算方法如下：相对迁移率(mr)=样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)。以标准蛋白质相对分子质量的对数(纵坐标)对相对迁移率(横坐标)作图，得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量八转膜胶放在3张缓冲液浸湿的滤纸上，盖上经甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及纸，与凝胶一样大小）排气泡，盖同样3张缓冲液浸湿的滤纸，排气泡。顺序：