生物技术在医药和农业领域的应用

“生命科学导论”系列讲座（9）文化素质教育课程学习目的

将病原物（如细菌、立克次体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的，可以通过注射或黏膜途径接种，并诱导机体产生针对特定致病原的特异抗体或细胞免疫，从而使机体获得消灭该病原能力的生物制品统称为疫苗。包括蛋白质、核酸、活载体或感染因子等。1.疫苗的定义众所周知,利用疫苗主动预防传染性疾病的最有效手段之一.疫苗对人类健康作出巨大贡献.第三代疫苗：核酸疫苗（DNA疫苗、基因疫苗）。指将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

特点：用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗，当引入机体后并不与宿主CS整合，而是通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主细胞产生特异性免疫应答。法国首先用基因工程方法在细菌和小鼠细胞中诱导产生乙肝病毒的蛋白质，并证明有免疫原性。后克隆乙肝表面抗原（HBsAg）基因，并获得大量的表面抗原。1986年美国FDA首先批准Merck公司基因工程疫苗（酵母表达系统）上市。

第二代疫苗：基因工程疫苗。将病原体的抗原（某种蛋白质）基因克隆在细菌或真核细胞内，使病原体的主要抗原基因在细菌或真核细胞中表达，利用表达的蛋白质或多肽作为疫苗。特点：利用病原体的某些抗原成分作为疫苗。用于不能或难培养的、危险性大的病原物。制备成本低廉，易发展多价疫苗。核酸疫苗（DNA疫苗、基因疫苗）

1990年，Wolff首先报道了小鼠肌肉注射质粒DNA，质粒及其携带的基因可以被细胞摄取并表达。所谓核酸疫苗是将含有编码蛋白质基因序列的质粒载体，经过肌肉注射或微弹轰击等导入体内，通过宿主细胞表达系统表达抗原蛋白，诱导宿主对该抗原的免疫应答，达到预防和治疗目的。这种疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和减毒活疫苗激发机体强免疫反应的双重性，且免疫效果持久、制备简单、低廉等优点。要求：早期、特异、快速、灵敏、操作简便

ELISA原理：将酶与抗体（原）交联形成酶-抗体(原)复合物（常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)或脲酶等）；另外将抗原（体）吸附在以聚苯乙稀制成的微孔滴定板上，使之固相化，免疫反应和酶促反应均在其中进行。利用抗原与抗体的特异结合以及酶将无色底物催化成有色底物，根据底物颜色的有无以及颜色的深浅判断阴性或阳性反应以及反应强度。1.

免疫学诊断

底物酶标AbⅡ产物待检样本（特异AbⅠ）测定抗体的间接ELISA法测定抗原的双抗体夹心法受检样品中的抗原已知病原物特异Ag用被检抗原免疫动物获得的AbI用抗原免疫另一动物获得的特异AbI酶标AbⅡ基因工程抗原

一是体外培养病原体，再将病原体收集，经一系列处理后制成；二是对于不能进行体外培养的病原体，只能从受感染的动物或病人的组织分离收集病原体，再经一系列的处理后制成。

基因工程抗原：如疫苗生产一样，将抗原基因克隆在细菌或真核细胞表达系统中，由这些表达系统生产大量的抗原。

间接ELISA法测定抗体必需首先制备大量的抗原，并将之包被于微孔板上。传统的抗原制备方法一般有两种：危险、质量难以控制，难以标准化。生产过程不必接触病原体，也便于标准化生产，成本低廉。多克隆抗体与单克隆抗体主要缺点：■特异性较低：不同病原体间可能会有相似的抗原决定簇，假阳性率较高；■质量难于控制：被免疫的动物的个体差异，各批次的抗体间有差异；■成本高。

单克隆抗体○免疫淋巴细胞和骨髓瘤细胞的制备○两种细胞的融合○从融合细胞中筛选出杂交瘤细胞○特异杂交瘤细胞的克隆化○特异杂交瘤细胞生产特异抗体（单克隆抗体）单克隆抗体杂交瘤单克隆抗体的应用范围2.1基因诊断概述蛋白质是生命的体现者，DNA是遗传的物质基础，基因是DNA分子上的功能片段，是遗传的基本单位。人类患各种疾病很大程度是由于执行某一功能的蛋白质分子出现异常。而这种不同和异常取决于控制其合成的基因的不同和异常。传统的疾病诊断是以疾病或病原物的表型为依据。如果能够在基因水平直接检测与某种疾病相关的基因序列，或病原物的特异性基因片段，则可以克服传统诊断的不足，从根本上对疾病作出诊断。2.

基因诊断

病原物提取病原物DNADNA固定在硝酸纤维膜根据病原物特异DNA序列合成探针用荧光素标记探针根据是否检测到荧光来判断是否有探针所代表的病原物检测病人分离标本基本思路：将已知序列的特定基因（微生物、遗传病的特异基因片段）用同位素、荧光素等标记，制备成一种诊断试剂，即基因探针。由于其在适当条件下可与同源序列互补形成杂交体，因此使基因探针与待检测组织细胞内的基因片段发生杂交反应，通过探针上的标记观察探针是否与标本DNA结合，从而判断标本是否有与探针一致的片段，再对是否有遗传病或病原物感染作出诊断。诊断试剂2.3遗传性疾病的诊断临症诊断：指遗传病出现临床症状后所作的诊断。症状前诊断：指临床症状出现前所作的诊断。产前诊断：胎儿出生前所做的诊断(性别、单基因病、CS异常)。

目前大多数遗传病无有效的治疗方法，因此产前诊断对于降低遗传病的发病率，提高人口素质具有重要的意义。例如，一种由基因点突变导致常染色体退化的遗传病——镰状红细胞贫血症的检测。●夫妇之一有染色体畸变。●35岁以上的高龄产妇。●夫妇之一有开放性神经管畸形。●夫妇之一有先天性代谢缺陷。●X-连锁遗传病基因携带者孕妇。●有原因不明的习惯性流产的孕妇。●羊水过多的孕妇。●夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。●有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。需要进行产前诊断的对象羊水和胎盘绒毛膜检测3.

生物芯片与诊断

①从生物样品（血液或活组织）中分离纯化DNA或mRNA，并对其进行特异性扩增；②对待测样品进行标记（通常用荧光素标记的dNTP为底物，通过PCR使之进入新合成的DNA片段中）；③标记好的DNA样品与DNA芯片进行杂交，由于有大量DNA探针集成在芯片上，故可以一次检测大量生物样品；④杂交后漂洗去除未杂交的DNA分子；⑤携带荧光标记的样品结合在特定位置上，在激光激发下会发荧光。用于微阵列芯片制作的点样仪；封装在卡盒中的微阵列芯片;用于微阵列芯片荧光标记检测的激光共聚焦扫描器；微阵列芯片的局部放大；微阵列芯片上固定DNA探针的示意图。图中蓝色的DNA链是预先固定在芯片表面的捕获探针，红色的DNA链是与捕获探针互补的靶DNA分子。DNA芯片利用DNA杂交反应生物芯片每个点上有已知的DNA探针生物芯片在诊断上的应用生物治疗是用生物来源的制剂或调节人体生物反应的制剂（如细胞因子、免疫活性细胞、干细胞、单克隆抗体和变应原蛋白等）治疗疾病的方法。

◎用一些调节机体免疫反应的生物制剂，通过增强机体对肿瘤、病原物的抵抗力来治疗疾病（以前称之为免疫治疗）；

◎通过减轻机体对变应原的剧烈反应而治疗一些过敏性疾病；

◎通过补充机体必需的一些不参与免疫反应的活性成分（如胰岛素、凝血因子和基因等）1.生物治疗概述2.1基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗的转移系统，重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制。例：转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗重症综合性免疫缺乏症（SCID）。1991年，美国批准第一例对遗传病进行体细胞基因治疗方案。即将腺苷脱氨酶（ADA）基因导入4岁女患童体内。过程：先将人正常的ADA基因构建到反转录病毒载体上，然后用该载体转染患儿的白细胞，并用IL-2刺激细胞增殖。10天左右，白细胞在体外大量扩增，再经静脉输入患儿体内。

干细胞(stemcell)一词中的“干”译自“stem”，意为“树干”、“主干”，以示该类细胞在所有细胞中的地位。就像树的主干能生长出无数形态各异的枝桠一样，干细胞可以分化为很多形态和功能各异的细胞群。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的原始细胞，是形成人体各种组织、器官的祖先。

正常体细胞是高度分化的、具有独特功能的细胞，这种细胞完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。为了补充死亡细胞，机体保留一部分干细胞。一旦需要，这些干细胞可按照一定途径分裂、分化为具有一定功能的成熟细胞。如：人红细胞平均寿命120天，新的红细胞来源于造血干细胞，它能分化为红细胞、白细胞、巨噬细胞等各类细胞。

全能干细胞：具有完整的分化潜能，能分化形成生物的个体。

多能干细胞：具有多种分化潜能，能分化成多种单能干细胞。

专能干细胞：只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化的干细胞。如红系造血干细胞、皮肤干细胞和神经干细胞等。2.1.1干细胞的分类按组织来源分：

按分化潜能来分：存在于造血组织中的一群具特定分化潜能的原始造血细胞,可分化为红系,粒系,巨核系等造血祖细胞,并进一步分化产生红细胞，粒细胞，单核细胞，淋巴细胞及血小板等所有血液细胞。

2.1.2干细胞的应用前景2.1.2.1造血干细胞

从兔子的眼角膜中分离出角膜缘干细胞和角膜基质细胞，经过体外培养、扩增，并与可降解生物材料复合，构建出有“活性”的眼角膜组织，然后移植修复兔角膜缺损，形成了结构完整的透明角膜组织。

从成年老鼠的骨髓中抽取干细胞，注射到患有色素性视网膜炎但尚未失明的新生老鼠的眼睛中。注射后，眼睛