植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定

1植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定液相色谱-串联质谱法本标准规定了植物干花和干叶中金丝桃苷含量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于金丝桃科、蔷薇科、桔梗科、杜鹃花科、锦葵科等植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中金丝桃苷用乙腈水溶液超声提取，提取液浓缩定容后，用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，以下试剂均为分析纯。水应符合GB/T6682规定的一级水要求。4.1甲醇：色谱纯。4.2乙腈：色谱纯。4.3氯化钠：色谱纯。4.4标准品：金丝桃苷含量≥98%。4.5乙腈-水溶液（80:20,v/v)：分别取800mL乙腈和200mL水，混合均匀，备用。4.6标准储备液（1.0mg/mL准确称取金丝桃苷标准品10.0mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。置于棕色干燥器中，于-18℃下避光储存，有效期3个月。4.7标准中间液（10.0mg/L准确吸取上述标准储备液1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，置于棕色干燥器中，于-18℃下避光储存，有效期1个月。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱（配电喷雾离子源）。5.2分析天平：感量0.00001g和0.01g。5.3超声波仪。5.4离心机：转速不低于5000r/min。5.5氮气吹干装置。26试样制备与保存取适量代表性试样，将植物烘干或晒干，制成干叶或干花，碾成粉末后过40目筛。用洁净密封袋或试7测定步骤7.1提取、净化分别准确称取植物干叶或干花粉末两份平行试料各1.00g（精确值±20mg加入10mL乙腈水溶液（80:20,v/v)于50mL离心管中，加入氯化钠2～3g,超声提取30分钟，5000r/min离心5min，上清液转入另一个50mL离心管中，残渣再加入10mL乙腈水溶液（80:20,v/v)，重复提取一次，合并上清液，提取液于60℃下氮气吹至近干，用10%甲醇水溶液（10:90,v/v)定容至1.0mL，经0.22µm孔径滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱仪测定；7.2标准曲线绘制溶剂标准溶液：准确量取金丝桃苷标准中间液适量，用50%甲醇水溶液稀释配制成金丝桃苷浓度为60、100、150、200、400、500µg/L的系列标准溶液，现配现用，供液相色谱-串联质谱测定。基质匹配标准溶液：取各自空白组织试样，按上述方法处理制得其空白基质溶液，准确量取金丝桃苷标准中间液适量，分别用空白基质溶液稀释，配制成金丝桃苷浓度为60、100、150、200、400、500µg/L的系列标准溶液，现配现用，供液相色谱-串联质谱测定。7.3测定7.3.1液相色谱条件色谱柱：C18(1.8µm，2.1×100mm)流动相：A：纯水，B：甲醇，梯度洗脱，洗脱条件见表1流速：0.25mL/min表1液相色谱梯度洗脱条件时间,minA:%B：%0900.5905905.8906908907.3.2质谱条件电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI-)；离子源：电喷雾离子源扫描方式：负离子扫描检测方式：多反应离子检测(MRM)；脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；3喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度；监测离子参数情况见表2。表2MRM监测模式下金丝桃苷质谱优化条件化合物母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞诱导解离电压E/V碰撞能量U/V金丝桃苷463299.9*22270.836254.9367.3.3定性测定通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于5%；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在金丝桃苷成分。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差单位为百分率相对离子丰度>5020~5010~20≤10允许的相对偏差±207.4定量测定取试样溶液、溶剂标准溶液或基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，以外标法定量，标准溶液及试样溶液中金丝桃苷峰面积均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，金丝桃苷标准溶液液相色谱-串联质谱图参见附录A。7.5空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。8结果计算试样中金丝桃苷含量按式(1)计算：X=。。。。。。。。。。。。（1）式中：X—试样中金丝桃苷含量(µg/kg)Ci—试样溶液中金丝桃苷浓度(µg/L)；Cs—标准溶液中金丝桃苷浓度(µg/L)；Ai—试样溶液中金丝桃苷峰面积；As—标准溶液中金丝桃苷峰面积；V—样液最终定容体积(mL)；m—试样质量(g)；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。49检测方法的灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法的检测限均为20µg/kg、定量限均为60µg/kg。9.2准确度本方法在60μg/kg～500μg/kg添加浓度水平上的回收率为80%～110%。9.3精密度本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。12000800012000800040000（资料性附录）2000150010005000TICTIC02468图1金丝桃苷标准品（60.0µg/L）总离子流图800006000040000200000m/zm/z463.0>299.902468XAxisTitle463463.0>254.9m/z02468XAxisTitle3000020000100000m/zm/z463.0>270.80