(高清版)GBT 42821-2023 贝类包纳米虫病诊断方法

贝类包纳米虫病诊断方法Diagnosticmethodsforbonamiosisofmolluscs2023-08-06发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I 12规范性引用文件 l3术语与定义 14缩略语 15试剂和材料 16器材和设备 27临床症状 38采样 39组织印片检查 310组织病理检查 311PCR检测 412荧光PCR检测 513综合判定 6附录A(规范性)组织印片、组织病理检查及DNA提取相关溶液配制 7附录B(资料性)贝类包纳米虫病 附录C(资料性)目标扩增序列及引物、探针的位置 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术柏建山。1贝类包纳米虫病诊断方法1范围本文件给出了贝类包纳米虫病(bonamiosis)诊断的缩略语、试剂和材料、器材和设备，描述了临床本文件适用于牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)和杀蛎包纳米虫(Bonamiaexitiosa)引起的贝类包纳米虫病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)Ct:扩增循环数(cyclethreshold)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基荧光素(carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate)Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris·HCl)Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)5试剂和材料本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂。25.5生理盐水(0.9%):常温保存。5.610×PCR缓冲液(无Mg²+):-20℃保存。5.13乙酸铵(10mol/L):按A.5.14酚/三氯甲烷/异戊醇混合液：配制比例25:24:1。5.15乙醇溶液(75%):按A.6配制。5.21引物BonF:5.22引物BonR:5'-CTGATCGTCT5.24引物BonqR:5'-CATAAGTTAG5.25探针BonqP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'(10μmol/L),-20℃5.27核酸染料：4℃保存。6器材和设备6.6匀浆研磨器。6.7冷冻高速离心机。6.8二级生物安全柜。36.9普通PCR仪。6.10荧光PCR仪。6.11水平电泳仪。6.12凝胶成像仪。6.13水浴锅。6.14微量移液器。6.15电子天平。7临床症状患病贝类双壳闭合不全，严重时死亡，轻则无明显症状，见附录B。8采样8.1采样对象优先采集2龄及以上濒死的贝类。8.2采样部位8.3采集数量临床无症状贝类样品每个批次采集150个以上，临床有症状贝类样品每个批次采集30个以上。进口贝类样品的采样数量应符合GB/T18088的规定。8.4保存及运送取样应加贴标签，标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点、采样人员和养殖背景，样品应24h内冷链送达实验室，立即检测或保存于一80℃冰箱待检。9组织印片检查将鳃或心脏组织用吸水纸吸去多余水分后，用镊子将组织在载玻片上轻轻挤压涂片，使其形成薄层膜，自然晾干，丙酮或甲醇固定1min,滴加姬姆萨染液4滴～5滴，染色5min～10min,流水冲洗，晾干后置于400倍～1000倍显微镜下观察。9.2结果判定印片组织中发现虫体判为阳性。虫体呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色。常见干血细胞内，感染严重时，血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.1和图B.2。10组织病理检查用戴维森氏固定液固定样品，固定液与组织块的体积比为(15:1)～(20:1),固定24h～48h。4按A.13的要求采用组织切片机制备石蜡切片，封片后置于400倍～1000倍显微镜下观察。切片组织中发现虫体即判为阳性。虫体呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色，常见于血细胞内，感染严重时，血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.3。11.1实验室技术要求检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。11.2.1.1利用电子天平称取30mg～50mg组织样品，置于0℃~4℃的生理盐水(4℃冰箱预冷)中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后置于匀浆研磨器中并加入0℃~4℃(4℃冰箱预冷)的生理盐水，充分匀浆研磨。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。11.2.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K至终浓度100μg/mL,再加10%SDS至终浓度为1%(质量分数),上下颠倒混匀后置于50℃水浴锅中水浴3h,不时旋动。向匀浆液中按1:1体积比加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液(25:24:1),轻轻震荡混匀5min,置于冷冻高速离心机中，12000r/min离心5min。11.2.1.4吸取上层水相转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加入等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min,置于冷冻高速离心机中，12000r/min离心5min。11.2.1.5吸取上层水相转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加入100μL10mol/L乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(一20℃冰箱预冷)混匀，置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷冻高速离心机12000r/min离心10min,沉淀DNA,倾去上清液。11.2.1.7向沉淀中加入75%乙醇溶液500μL,轻轻混匀后采用冷冻高速离心机12000r/min离心5min,倾去上清液，室温晾干。11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提取试剂盒。在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10×PCR缓冲液(无Mg²+)2.5μL、MgCl₂溶液(25mmol/L)2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL、10μmol/L引物BonF和引物BonR各1.0μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,补充双蒸水至25.0μL。利用普通PCR仪进行PCR扩增，设置扩增程序如下：94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环；72℃延伸10min,4℃保温。5GB/T42821—202311.2.4琼脂糖电泳配制1%～2%的琼脂糖凝胶并加入核酸染料，待胶凝固后置于含有1×电泳缓冲液的水平电泳仪中，取5μLPCR扩增产物与1μL6×上样缓冲液混匀后加入加样孔中，同时取5μLDNA分子质量标准溶液加入加样孔中，进行电泳，电泳结束，在凝胶成像仪下观察。11.3结果判定11.3.1检测成立的条件阳性对照在300bp处有扩增条带，阴性对照300bp处无扩增条带，空白对照无任何条带，检测有效。11.3.2PCR检测结果判定若待检样品在300bp处无条带，则判为PCR检测核酸阴性。若待检样品在300bp处有条带，则判为PCR检测核酸阳性。11.3.3序列分析及包纳米虫种类鉴定对PCR检测为核酸阳性的样品PCR产物进行测序，测序结果同参考序列比对分析(见附录C中C.1、C.2),若序列中同时存在HaeⅡ和BglI两个酶切位点(见C.1),可判定样品为Bonamiaostreae核酸阳性。若序列中只存在HaeⅡ酶切位点(见C.2),则判定样品为Bonamiaexitiosa核酸阳性。12荧光PCR检测12.1实验室技术要求检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。12.2操作步骤按11.2.1规定执行。在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10×PCR缓冲液(无Mg²+)2.5μL、MgCl₂溶1.0μL、10μmol/L探针BonqP0.5μL、dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μL,加入模板DNA2.0μL,补充双利用荧光PCR仪进行荧光PCR扩增反应，设置扩增程序如下：95℃预变性4min;95℃变性15s,55℃退火30s,45个循环，每个循环结束后采集荧光数据。12.3结果判定12.3.1检测成立条件阳性对照Ct值≤35,且出现特异性扩增曲线；阴性对照无Ct值或者Ct值>40且无特异性扩增曲6GB/T42821—2023线，检测有效，否则应重新进行检测。12.3.2荧光PCR检测结果判定若样品Ct值≤35,则判定荧光PCR检测核酸阳性。若样品无扩增曲线或者Ct值>40,则判定荧光PCR检测核酸阴性。若35<Ct≤40,判定为疑似，此时可调整模板浓度后对样品重新进行荧光PCR检测，如果样品重复检测时的Ct值≤40,则判定荧光PCR检测核酸阳性；如果样品重复检测时无扩增曲线或者Ct值>40,则判为荧光PCR检测核酸阴性(荧光PCR扩增序列及引物、探针的位置见C.3)。13综合判定13.1疑似判定贝类组织通过组织印片检查、组织病理检查、PCR检测、荧光PCR检测，其中任一种检测结果为阳性，则判定为疑似包纳米虫病。13.2确诊判定13.2.1已知贝类包纳米虫病流行区内的贝类样品组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳性的，则确诊为贝类包纳米虫病。13.2.2已知贝类包纳米虫病流行区外的贝类样品组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳性的，需将样品送至参考实验室进行最后的确诊。7(规范性)组织印片、组织病理检查及DNA提取相关溶液配制A.1姬姆萨染液续研磨，最后加入甲醇，在56℃放置24h或者室温放置3d～5d后即可使用。A.1.2工作液：取贮存液采用蒸馏水10倍稀释即可，临用时配制。A.2戴维森氏固定液海水335mL95%乙醇330mL37%甲醛220mL冰乙酸115mL蛋白酶K20mg溶解后分装于1.5mL离心管中(0.25mL/管),-20℃下保存。水90mL加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热溶解即可。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和电子天平上乙酸铵77g加水定容至100mL,经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃贮存。A.675%乙醇无水乙醇加水25mL,混匀，定容至A.7TE缓冲液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)80.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至高压蒸汽灭菌，4℃贮存。2mLA.850×电泳缓冲液冰乙酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至室温贮存。A.91×电泳缓冲液50×电泳缓冲液加水定容至室温贮存。A.10苏木精染液的配制方法苏木精无水乙醇硫酸铝钾蒸馏水氧化汞冰乙酸分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。选用水溶性伊红。配方为：伊红1g、70%～75%酒精100mL、伊红用少许蒸馏水调成耀糊状，再加入酒精，边加边搅拌，直至彻底溶解，此时试剂有些浑浊，取0.1mL冰乙酸，加入试剂中，试剂逐渐转变A.12返蓝液的配制取5mL氢氧化氨，加入1000mL蒸馏水中即可。A.13石蜡切片制备取材固定24h,修整组织块，换固定液重新固定12h,自来水冲洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，无水乙醇30min3次，二甲苯30min,二甲苯5min～20min2次，放入石蜡二甲苯10min2次，然后依次通过无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min,再9通过蒸馏水3min后，苏木精染色5min～20min,自来水洗3min,1%盐酸酒精8s～15s,自来水洗3min后，返蓝液2min～5min,自来水5min,蒸馏水5min,然后依次通过50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇各3min进行脱水，0.5%伊红染液复染1min～2min,再依次通过95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各2min进行二次脱水，二甲苯透明2min2次，最后用封片树胶封片。(资料性)贝类包纳米虫病B.1疾病描述包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)、杀蛎包纳米虫(Bonamiaexitiosa)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或外套膜中而引起的水生动物的一种血液原虫病，是严重危害世界贝类养殖业的主要疾病，也是世界动物卫生组织(WOAH)规定的检疫性贝类寄生虫病。B.2病原现发现的包纳米虫包括5个种，除主要寄生在欧洲平牡蛎(Ostreaedulis)体内的牡蛎包纳米虫(Bonamiaostreae)外，还有寄生在悉尼岩牡蛎(Saccostreaglomerata)体内的鲁夫来包纳米虫(Bonamiaroughleyi)、欧洲平牡蛎(Ostreaedulis)体内的杀蛎包纳米虫(Bonamiaexitiosa)、近江牡蛎(Crassostreaariakensis)体内的成孢包纳米虫(Bonamiaperspora)、澳大利亚安加西牡蛎(Ostreaan-gasi)体内的包纳米虫未定种(Bonamiasp.)。该病原的感染力较强，含有该病原的悬液具有传染性，使其在寄主细胞内定位接触30min即可感染牡蛎，其中以颗粒血细胞中的病原感染力最强。造成广泛危害的主要为牡蛎包纳米虫和杀蛎包纳米虫。B.3易感宿主易感宿主包括欧洲平牡蛎(Ostreaedulis)、安加西牡蛎(Ostreaangasi)、帕尔希牡蛎(Ostreapuel-chana)、智利牡蛎(Ostreachilensis)、近江牡蛎(Crassostreaariakensis)、智利鹑螺(Tiostreachilensis)等贝类。B.4临床症状牡蛎感染包纳米虫病后通常表现为双壳闭合不全，严重时出现鳃丝损伤或死亡，但该症状也可能由其他疫病引起，并不能通过症状来判定是否感染了包纳米虫病。轻症则无明显症状。B.5地理分布包纳米虫感染欧洲平牡蛎引起死亡的报道。近十几年来，牡蛎包纳米虫病的流行趋于缓和，虽未出现重大的流行，但在美国、英国、爱尔兰、加拿大等地时有发生，流行率从百分之零点几到百分之三四十不等。我国目前尚未有水生动物包纳米虫病发生的报道。B.6组织印片检查包纳米虫呈球形或卵圆形，虫体大小为2μm～5μm,细胞核红染，细胞质蓝染，多寄生在细胞内。包纳米虫见图B.1中箭头所指位置。GB/T42821—2023图B.1组织细胞内的包纳米虫在显微镜下可观察到虫体寄生于血淋巴细胞内，呈球形或卵圆形，大小为2μm～5μm,姬姆萨染色后，细胞核红染，细胞质蓝染。包纳米虫见图B.2中箭头所指位置。图B.2牡蛎血液中的包纳米虫B.8组织病理学检查包纳米虫呈球形或卵圆形，虫体大小为2μm～5μm,细胞核红染，细胞质蓝染。包纳米虫见图B.3中箭头