《食品微生物检验技术》课件-血清学反应试剂制备

血清学反应试剂制备目录/Contents1基本概念pH指示剂的配制技术血清学鉴定2血清学反应常用试剂和培养基的制备301基本概念血清是指血液凝固析出的淡黄色透明液体。血清蛋白是指为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。血清学检验就是利用抗原-抗体反应的显著特异性，进行细菌的鉴别和血清学定型。细菌菌体或鞭毛等抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。01基本概念血清学检验指根据抗原与相应的抗体在适宜的条件下，能在体外发生特异性结合的原理，在体外用已知抗体（或抗原）检测抗原（或抗体）。01基本概念

2.血清学反应的一般特点（1）抗原抗体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。（2）抗原抗体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。01基本概念

2.血清学反应的一般特点（3）抗原抗体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。（4）血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。01基本概念3.血清学检验的类型血清学试验可分为血清学鉴定和血清学诊断两部分。血清学试验既可定性，又可定量。用已知抗体（即含特异抗体的免疫血清或单克隆抗体等）检测标本中或分离培养物中未知细菌的种、型或细菌抗原，称为血清学鉴定；而用已知细菌或特异性抗原检测患者血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，作为某些感染性疾病的辅助诊断，称为血清学诊断。02血清学鉴定1．凝集反应（1）直接凝集反应①玻片凝集法方法是取已知抗体（诊断血清）滴加在载玻片上，直接从培养基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为反应阳性。02血清学鉴定1．凝集反应（1）直接凝集反应②试管凝集法此法是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。02血清学鉴定（2）间接凝集反应法此反应法是指将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体表面，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集的反应。02血清学鉴定（2）间接凝集反应法间接凝集反应主要可分为正向间接凝集试验、反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验和协同凝集试验。但根据载体的不同，还可以分为乳胶凝集、血球凝集、炭凝集、SPA协同凝集等。02血清学鉴定①正向间接凝集试验即将已知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集现象，用以检测未知抗体。②反向间接凝集试验此试验是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。适用于可溶性和颗粒性抗原的检出，如从食品中检出肉毒毒素和葡萄球菌肠毒素等菌体。02血清学鉴定③间接凝集抑制试验它是将已知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后加入有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如果已知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合后，不出现颗粒凝集的现象，也可称为正向或反向间接凝集抑制试验。02血清学鉴定④协同凝集试验协同凝集反应属于间接凝集反应的一种类型。它所用的载体是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黄色葡萄球菌。本试验法操作简便、快速、敏感性高，易于观察结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群（型），如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙门氏菌及志贺菌等细菌。02血清学鉴定2．沉淀反应（1）环状沉淀反应此反应是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。02血清学鉴定2．沉淀反应（2）絮状沉淀反应将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。02血清学鉴定2．沉淀反应（3）琼脂扩散试验利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。02血清学鉴定3．补体结合反应此反应法是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应。血清学反应的判定是这样的：在试验时，先将定量补体（使用新鲜的豚鼠血清）加入待检系统中，使抗原抗体优先结合补体。01血清学鉴定3．补体结合反应如果待检系统中抗原与抗体相对应，加入的补体可被抗原抗体复合物所结合而固定，不再与以后加入的溶血系统起反应，不出现溶血现象，为补体结合反应阳性；如待检系统中的抗原抗体不相对应，则游离的补体与后面加入的溶血系统反应，从而出现溶血，为补体结合反应阴性。03血清学反应常用试剂和培养基的制备1．0.1％十二烷基磺酸钠（用于制备沙门氏菌样品）用电子天平称取0.2884g十二烷基磺酸钠（SDS）溶于100mL水中，并转移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL，摇匀即可。2．营养肉汤（用于培养沙门氏菌）蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，25℃条件下调整PH值7.2±0.2，配制好的溶液分装进三角瓶或试管，121℃高压灭菌15分钟备用。03血清学反应常用试剂和培养基的制备3．1.2%~1.5%琼脂培养基称取12g-15g的琼脂，溶于1000mL的蒸馏水中，加热使之溶解，室温条件下慢慢冷却即可。4．生理盐水称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升，即得浓度为0.9%的生理盐水。5．15%氯化钠称取15克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升即得。03血清学反应常用试剂和培养基的制备7．PCA平板计数琼脂培养基（用于菌落总数测定的）称取胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，加入蒸馏水1000mL，煮沸溶解，调节pH7.0士0.2，然后分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。即得。8．月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（金黄色葡萄球菌的检测）称取胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，氯化钠5.0g，乳糖5.0g，磷酸氢二钾2.75g，磷酸二氢钾2.75g，月桂基磺酸钠0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，调整PH6.8士0.2，然后分装到有玻璃小导管的试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。03血清学反应常用试剂和培养基的制备9．脑心浸出液肉汤（用于金黄色葡萄球菌的检测）（1）配方胰蛋白质胨10.0g，氯化5.0g，磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O)2.5g，葡萄糖2.0g，牛心浸出液500mL。（2）制法加热溶解，调节pH7.4±0.2，分装16mmX160mm试管，每管5mL，置121℃高压灭菌15min。03血清学反应常用试剂和培养基的制备10．10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤（LST）（用于金黄色葡萄球菌的检测）（1）配方胰酪胨（或胰蛋白胨）17g，植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g，氯化钠100g，磷酸氢二钾2.5g，丙酮酸钠10g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL。（2）制法将上述成分混合，加热，轻轻搅拌并溶解，调节pH7.3±0.2，分装，每瓶50mL,121℃高压灭菌。03血清学反应常用试剂和培养基的制备11．缓冲蛋白胨水（BPW）（用于沙门氏菌的前增菌）称取蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钠9g，磷酸二氢钾1.5g，蒸馏水1000mL。加热搅拌至溶解，调节pH7.2，121℃高压灭菌15min。12．250μg/mL牛血清白蛋白标准液准确称取250mg标准牛血清白蛋白，用0.03mol/LpH7.8的磷酸缓冲液溶解并定