从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成为结合酶等电点为6.2)的技术路线

生物大分子的分离纯化和

特定酶分离纯化技术路线的设计16级长学制临床三班范佳祺常钰涵赵瑾冯璞12目录1.研究目的2.主要内容3.研究方法和手段4.文献综述5.工作进度安排6.预期成果22024/5/141.研究目的锻炼自主学习和查阅文献的能力锻炼设计实验的能力32024/5/142.主要内容自主设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶的技术路线并理解实验各步骤的原理42024/5/143.研究方法和手段研究方法：文献研究法——搜集整理相关研究资料为研究做准备研究手段：以传统文献检索手段为主，辅以网络、数据库等手段，开展资料、搜集数据整理等工作52024/5/144.文献综述生物大分子的分类：蛋白质、核酸、脂质、糖类接下来分类讲解如何从生物样品中分离纯化以上四类生物大分子的技术路线62024/5/144.1.1蛋白质的分离纯化分离方法：透析超滤除蛋白质溶液中的小分子化合物浓缩方法：丙酮沉淀、盐析、免疫沉淀纯化方法：电泳、层析72024/5/144.1.2核酸的分离纯化——DNA①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原；②然后利用淀粉酶除去多糖；③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离；④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白质；⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。82024/5/144.1.2核酸的分离纯化——RNA前四步与DNA的分离纯化方法相同，之后可通过苯酚水溶液抽提或脱氧核糖核酸酶处理除去DNA。可再利用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法提取所需种类RNA。92024/5/144.1.3脂质的分离纯化利用FolchMethod从组织中分离和纯化脂质先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织液1:20的量和氯仿/甲醇一起组织匀浆，分层后在室温下在摇床中摇动15到20分钟匀浆通过滤纸过滤或者离心获得液体在离心获得的液体中加入0.2倍体积（4ml）的水或者0.9%的生理盐水涡旋几秒钟后混匀，然后2000rpm离心得到两相溶液，通过虹吸去掉上层用作神经节苷脂类的分析和有机小的极性分子的分析，如果需要的话用甲醇/水（1/1）的溶液将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让甲醇/水与下层混合通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相中含有脂质，如果体积在2到3ml以下，则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩102024/5/144.1.4糖类的分离纯化提取：动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。分离：分级沉淀法、金属络合物法、制备性区域电泳、色谱分离法和膜分离法。其中分级沉淀法主要有有机溶剂分步沉淀法、盐析法及季铵盐沉淀法；色谱分离法分为凝胶柱色谱和离子交换色谱法；膜分离法主要有超滤和微滤法。纯化：Sevagr法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法、盐酸法、酶法、有机溶剂混合法除去蛋白质。用透析法、柱离子交换法和纤维滤器透析法去离子。112024/5/144.2设计一个从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶（该酶由三种不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线并理解实验各步骤的原理材料的选择技材料的预处理术酶的提取路酶的分离线酶的纯化酶纯度的检验122024/5/144.2.1材料的选择因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。132024/5/144.2.2材料的预处理细胞破碎：机械破碎法。可选用捣碎法或匀浆法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。142024/5/144.2.3酶的提取盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低。152024/5/144.2.4酶的分离等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法进行分离。等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。162024/5/144.3.5酶的纯化结晶：盐析结晶法——加固体盐法、饱和盐溶液、透析扩散法。浓缩：真空蒸发浓缩——在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。一般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。干燥：真空干燥法——真空干燥是在与真空系统相连接的密闭干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真