微生物资源与微生物新药发现

章

微生物资源的多样(Yang)性与微生物新药的发现

第一页，共八十三页。第一节稀有放线菌是产生微生物新药的重要源泉第二节黏细菌是一类值得关注的微生物新资源第三节从植物内生菌中筛选微生物新药第四节从海(Hai)洋微生物中筛选微生物新药第二页，共八十三页。第一节稀有放线菌(Jun)是产生微生物新药的重要源泉所谓的稀有放线菌（rareactinomycetes)即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。第三页，共八十三页。稀有放线菌是产(Chan)生微生物

新药的重要源泉到1974年止，放线菌来源的抗生素几乎都是由链霉菌属产生的（约占2000种抗生素中的95%）。但在随后6年的报导中，由放线菌产生的仅占25%。事实证明，稀有放线菌是发现新抗生素的极好来源，且它们产生各种不同抗生素的能力不亚于链霉菌属。同样，细菌和霉菌也仍是产生新的生理活性物质的源泉，特别是近年来从霉菌的代谢产物中发现新的生理活性物质的数目正在不断增加。第四页，共八十三页。第五页，共八十三页。第六页，共八十三页。小单孢菌能产生独特(Te)化学结构的生物活性物质能产生独特化学结构的生物活性物质。近年来从小单孢菌中发现了引人注目的结构新颖的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicinγ1（结构如图所示），由棘孢小单孢菌Ｍ.echinosporaspcalichensis所产生，与肿瘤细胞作用时,分子中烯二炔部分起“分子核弹头”作用，三巯基部分起“扳机”作用，寡糖部分起“识别”作用，能选择性地结合并切除ＤＮＡ双链中的特定片段，如ＴＣＣＴ、ＴＣＴＣ和ＴＴＴＴ。/dxbzl/第七页，共八十三页。Calicheamicinγ1的化学结(Jie)构

第八页，共八十三页。小单孢菌能产生独(Du)特化学结构的生物活性物质碳黑小单孢菌Ｍ.carbonacea产生强效的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的寡糖类抗生素ziracin(如图3－所示)。它对甲氧西林和万古霉素耐药菌作用很强。对甲氧西林敏感和耐药的肺炎链球菌的ＭＩＣ为0．032～0．125μｇ/ｍｌ，对青霉素Ｇ耐药菌的ＭＩＣ为0．125～8μｇ/ｍｌ，对万古霉素敏感和耐药菌的ＭＩＣ为0．45～2μｇ/ｍｌ。ＥＤ50为2．5ｍｇ/ｋｇ。静注剂量1ｍｇ/ｋｇ的血浓度为10μｇ/ｍｌ。虽已进入Ⅲ期临床试验，但没有获得ＦＤＡ批准。除产生抗生素外，小单孢菌还产生许多非抗生素的生物活性物质。

第九页，共八十三页。Ziracin的化(Hua)学结构

第十页，共八十三页。游动放线菌(Actinoplanesp.)ATCC3076产生(Sheng)的抗细菌抗生(Sheng)素雷莫拉宁。

第十一页，共八十三页。黏细菌

一类值得(De)关注的微生物新资源Epothilons是由粘细菌纤维束菌(Sorangiumcellosum)产生的新型细胞毒化合物。它是一种新的16元环多酮大环内酯,含有一个噻唑基和环上的一个环氧结构(结构如图所示)。该菌产生Ａ和Ｂ两种主要组分、Ｃ～Ｆ四种次要组分以及36种极微量成分。第十二页，共八十三页。Epothilons的(De)化学结构

第十三页，共八十三页。从植物内生菌中筛选(Xuan)微生物新药

要利用植物内生菌这一资源丰富的宝库，首先要将内生菌从植物中有效地分离出来，然后应用分离色谱层析等生物分析方法从内生菌培养物滤液中分离并鉴定出令人感兴趣的生物活性物质，如：紫杉醇、cryptocin、oocyclin、isopestacin、pseudomycin和ambuicacid等。本文主要阐述了植物内生菌分离的一般规则，其生物活性代谢产物的最新研究进展，以期读者对植物内生菌的重要性有更深刻的认识。第十四页，共八十三页。

天然药物的筛选已成为现今的一个研究热点，植物是天然药物的主要来源之一。生活在植物组(Zu)织中的植物内生菌，由于其与植物的关系密切，同时其产生的丰富多样的次生代谢产物具有多种生物活性，因此从中发现新的有意义的化合物的潜力相当大，其作为新的治疗药物或前体药物的潜在来源已经引起人们的广泛重视。第十五页，共八十三页。一、历(Li)史概况1898年Vogl从黑麦草的种子中首次分离出第一株内生真菌。但在此后的70年间，内生菌的研究进展缓慢；直到70年代，Bacon等人发现高羊茅中的内生真菌和毒素的产生有关，从此以后植物内生菌的研究在国际范围内引起了广泛的重视。第十六页，共八十三页。二、植物内生(Sheng)菌第十七页，共八十三页。目前较常(Chang)用的宽泛实用性概念：

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌和细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。即我们可以把植物内生菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏的宿主体内的病原微生物。第十八页，共八十三页。三(San)、植物内生菌的生物多样性宿主植物种类多样性内生菌自身种类多样性内生菌在植物组织中分布多样性第十九页，共八十三页。内生菌普遍存在于目前已研究过的各种陆生及水生植物中。目前全世界至少已在80个属(Shu)290多种禾本科植物中发现有内生真菌。自20世纪70年代后期，内生菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、云衫、红杉、紫杉、松柏等以及阔叶的桉树、栎树、桦树、桤木等植物树皮、枝叶中相继被发现并得到了广泛的研究。进而在多种灌木、草本植物以及栽培作物、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中也发现了内生菌。第二十页，共八十三页。对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌和细菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种。在(Zai)热带雨林植物中，内生菌的多样性更为突出。例如：Anorld等人最近分析了巴拿马中部雨林中两种植物叶子中的内生菌，结果发现分离自83片健康叶子上的内生菌可多达418个形态学种第二十一页，共八十三页。主要(Yao)内生真菌子囊孢子类：核菌纲盘菌纲腔菌纲广泛分布的种属：半壳霉属拟隐孢霉属拟茎点霉属叶点霉属第二十二页，共八十三页。常见内(Nei)生细菌大多数为土壤微生物类群：假单孢菌属芽孢杆菌属肠杆菌属土壤杆菌属第二十三页，共八十三页。内生真菌的菌丝生长于植物组织的细胞间，分布于叶鞘(Qiao)、种子、花、茎、叶片和根。其中叶鞘(Qiao)和种子的菌丝含量最多而叶片和根的含量极微。第二十四页，共八十三页。四、植物内(Nei)生菌的作用促进宿主植物的生长增强宿主植物的抗逆性产生具有生理活性的代谢产物第二十五页，共八十三页。

内生菌(Jun)能产生IAA等植物生长激素内生菌增强宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收如：禾本科农作物上的内生细菌具有很强的固氮能力。感染内生真菌的牧草对氮、磷的摄取能力也有所提高。

第二十六页，共八十三页。

感染内生菌的宿主植物对环境具有(You)很强的抗逆性，如抗干旱、抗病原细菌和真菌、抗线虫、阻抑昆虫和食草动物的采食等。第二十七页，共八十三页。

在内生菌中，有对宿主(Zhu)植物体内某些活性成分的形成有重要影响者，也有产生和宿主(Zhu)植物相同或相似的生理活性成分。第二十八页，共八十三页。五、植物内生菌(Jun)产生的生理活性物质抗生素类物质抗肿瘤活性物质植物生长调节物质杀昆虫物质其他类型的活性产物第二十九页，共八十三页。1.抗生素(Su)类物质随着细菌耐药性的出现激发了人们寻求更多更好的抗菌素；同时，由于艾滋病和器官移植引起的真菌感染人数不断增加，对于高效抗真菌制剂的需求也不断增强；加之目前治疗原生动物寄生感染药物的匮乏，寻找更新更有效的治疗药物来解决这些问题已迫在眉睫。以往，抗生素的主要来源是土壤微生物。而今，植物内生菌这一多样性十分丰富却尚未开发的微生物类群看来是一巨大资源

第三十页，共八十三页。刺(Ci)盘孢属内生菌Colletotrichumgloeosporicoides产生的Colletotricacid抗微生物活性第三十一页，共八十三页。内生(Sheng)菌Colletotrichumsp产生的6-isopenylindole-3-carboxylicacid3β,5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7,22-diene

3β,5α-dihydroxy-6β-phenylacety-loxy-ergosta-7,22-diene抗微生物活性，对人畜和植物病原真菌和细菌有良好抑制作用第三十二页，共八十三页。内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina产生的新型(Xing)环肽抗生素cryptocandin对癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌具有强烈抑杀作用其MIC与临床应用的抗真菌药amphotericinB相当，具有良好开发前景第三十三页，共八十三页。内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina产生的(De)酰胺类生物碱cryptocin对稻瘟病菌及其他多种植物病原真菌具有很强的抑杀作用第三十四页，共八十三页。内(Nei)生菌Cytonaemasp.产生的CytonicAcidA(1)

和CytonicAcidB(2)抑制人细胞肥大病毒组装第三十五页，共八十三页。镰孢霉属内生真菌Fusariumsp.CR377产生的一种新型(Xing)的酮内酯（pentaketide）化合物对白色念珠菌有较强活性第三十六页，共八十三页。内生真菌FungusCR115产生的一(Yi)个二萜化合物GuanacastepeneA对多种革兰氏阳性和阴性细菌和白色念珠菌有活性第三十七页，共八十三页。内生菌Geniculosporiumsp.产生的(De)Geniculol(1)

和CytochalsinF(2)杀藻剂第三十八页，共八十三页。内生真菌Pestalotiopsisjesteri产生的新的环己(Ji)烯酮环氧化合物Jesterone对引起大多数植物致病的致病真菌有选择性活性第三十九页，共八十三页。内生菌(Jun)Pestalotiopsismicrospora产生的Ambuicacid抗真菌剂第四十页，共八十三页。内生菌Phomasp.NRRL2

5697产生的5种新的化合物PginadecakubsA-D(1-4)&PginaoebtebibeA(5)具有抗革兰氏阳性(Xing)菌活性(Xing)第四十一页，共八十三页。拟点霉属内生菌Phomopsissp.产(Chan)生的PhomoxanthonesA(1)&B(2)是两个新的氧杂蒽酮二聚体具有显著的抗疟疾和抗结核活性第四十二页，共八十三页。

分离自(Zi)锡兰桂小枝的内生菌Muscodor，其所释放的挥发性物质（醇，酯，酮，酸和脂）对人及植物的致病真菌和细菌有很强的杀伤性。第四十三页，共八十三页。分离自(Zi)欧洲紫杉（Taxusbaccata）的内生真菌Acremoniumsp.产生的白灰制菌素A具有抗真菌活性。第四十四页，共八十三页。

分离自欧洲杜松（Juniperuscommunis）的内生真菌Hormonema，从其发酵液中分离出一种新的三萜糖苷(Gan)对念珠菌属和曲霉属的真菌具有很强的活性

第四十五页，共八十三页。2.抗肿瘤活(Huo)性物质1）紫杉醇（Taxol）紫杉醇是一种以极低含量存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物，临床上是治疗乳腺癌、子宫癌和卵巢癌的良效药物，自1992年投入市场以来，取得了临床疗效和市场效应的极大成功。第四十六页，共八十三页。Taxol第四十七页，共八十三页。

1993年美国学者Stierle等人首次从短叶紫杉（Taxusbrevifolia）的树皮中分离出一株内生的真(Zhen)菌新种Taxomycesandreanae，在培养液种能产生紫杉醇和其他紫杉烷类化合物。第四十八页，共八十三页。

至今已在短叶紫杉、喜马拉雅红豆衫、欧洲红豆衫、南方红豆衫、云南红豆衫、落羽衫、榧树中分离到了许多种能产生紫杉醇的内生真菌和放线菌。其中内生真菌微孢拟盘多毛孢的紫杉醇产量已初(Chu)步显示出其商业潜力。第四十九页，共八十三页。HostplantsFungalentophytesFounderandyearTaxusbrevifoliaTaxomycesandreanaeStierleetal.,1993TaxuswallichianaPhomasp.Yangetal.,1994TaxustaxifoliaPestalotiopsismicrosporaLeeetal.,1995TaxuswallichianaPestalotiopsismicrosporaStrobeletal.,1996TaxodiumdistichumPestalotiopsismicrosporaLietal.,1996TaxusbrevifoliaPestalotiopsisspp.Pulicietal.,1997WolemianobilisPestalatiopsisguepiniStrobeletal.,1997TorreyagrandifoliaPericiniasp.Lietal.,1998TaxuswallachiaraSeimatoantleriumtepuienseBashyaletal.,1999TaxusmaireiTuberculariasp.Wangetal.,2000TaxuswallichianaSporormiaminimaTrichotheciumsp.Shresthaetal.,2001一些能够产生紫杉醇类物质的植物内生菌及其植物宿(Su)主

第五十页，共八十三页。这些发现为人类突破植物资源(Yuan)周期长、不可再生等限制，利用植物内生菌来工业化发酵生产重要植物药物提供了新的思路。第五十一页，共八十三页。2）ras－法呢(Ne)基转移酶抑制物

抑制法呢基－蛋白转移酶（FPTase）或ras－法呢基转移酶的化合物往往具有抗肿瘤活性。

第五十二页，共八十三页。A.LinghamRB等曾报道毛壳属内生真菌Chaetomellaacutisea产生的长链脂肪酸ChaetomellicacidA和B以及从一种小檗叶的某种内生真菌中发现的天然产物oreganicacid可选(Xuan)择性抑制法尼基－蛋白转移酶（FPTase），具有抗癌活性。第五十三页，共八十三页。B.IshiiT等报道，从Phomasp.中分离得到的一种生物碱TAN－1813可抑制鼠脑ras－法尼基转移酶，对各种人体肿瘤细胞的增殖也有抑制作用，并可引起NIH3T3/k－ras细胞形态的改变。

此外，内生菌Coniothyriumsp.产生的醌类化合物对ras－法呢基转移酶也具(Ju)有很高的抑制活性。第五十四页，共八十三页。3）植(Zhi)物黄酮类物质植物中的一些黄酮类物质，如香豆素，异香豆素等，具有综合的抗癌活性，在分离自加拿大Cirsiumarvense的一个内生真菌Myceliasterila的发酵液提取物中发现了新的异香豆素。从中国南海红树嫩叶分离出来的内生真菌No.2533，其发酵液提取物分离出2种新的异香豆素类化合物enalinA和B，均具有抗癌活性。第五十五页，共八十三页。4）生(Sheng)物碱类

从来源于传统药用植物雷公藤的内生真菌Rhinocladiellasp.

中发现了三种新生物碱，实验结果表明它们对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用第五十六页，共八十三页。此外，从FicusmicrocarpaL的树皮中分离到的一株未鉴定的内生菌的发酵液(Ye)中分离到一种新的生物碱nomofungin，该化合物能干扰培养的哺乳类细胞微丝并且对于LoVo和KB细胞有轻微的毒性，是一种新型的微丝干扰剂第五十七页，共八十三页。5）其(Qi)它BradySE等通过BIA法从一株内生真菌分离到具有抗癌活性的二蒽醌类化合物cytoskyrinA。HuangY等也使用MTT法从三种药用植物中筛选具有抗癌活性的植物内生真菌。这些结果表明植物内生真菌是新的抗癌药物或前体的重要来源。第五十八页，共八十三页。已(Yi)有多篇文章报道内生真菌可产生植物生长激素物质如：Mcinroy等人从玉米、棉花上分离到具有促进植物生长的内生细菌。从柑橘属果树中分离出来的Penicillium.Italicum也能产赤霉素（GA）。

在对5种从药用植物中分离到的内生菌进行研究时发现，它们各自的发酵液中都含有至少一种植物激素：GA，IAA，ABS（Abscisicacid），Z（Zeatin），ZR（Zeatinriboside）,这些由内生真菌产生的植物激素是揭示内生真菌促进药用植物生长机制的重要物质第五十九页，共八十三页。禾本科植物内生真菌能产生4大类即：有机胺类（peramine）吡咯里西啶类（loline）吲哚二萜衍生物类（lolitremB）麦角碱类（ergovaline）多达十种的生物碱，这些生物碱具(Ju)有抗病原菌，抗线虫，增强植物他感作用等多种生物学活性，其中大多数对食草昆虫乃至哺乳动物（牛、羊）具(Ju)较强的毒性。第六十页，共八十三页。从内生菌感染的一种草熟禾中分离到数(Shu)个对蚊子幼虫有毒性的黄酮类化合物。从云杉等针叶树的内生真菌的次生代谢产物中，Findlay等人发现了一系列具抗虫活性的物质。第六十一页，共八十三页。

雷公藤的内生真菌Fusariumsubglutinans产生的2中二萜化合物(Wu)subgutinolA和B具有无细胞毒性的免疫抑制作用subgutinolA第六十二页，共八十三页。六(Liu)、前景从各个层次上深入探讨内生菌－寄主之间的相互作用，将有助于了解内生菌的生物学本质以及未知生态学作用从传统药用植物以及一下特殊环境中植物的内生菌代谢产物中寻找新型活性物质，将继续是内生菌研究的主流分子生物学手段将在内生菌研究的各个方面发挥重要作用第六十三页，共八十三页。植物内生菌的生境特殊性决定了其(Qi)既有理论研究的广度和深度，又有多方面的应用潜力，是个潜力巨大，尚待开发的微生物新资源。第六十四页，共八十三页。第四节

从海洋微生物中筛选微生物新(Xin)药一、研究背景和现状二、海洋微生物的生活习性及其多样性三、海洋微生物活性成分的研究及药物的开发四、海洋微生物药物研究展望第六十五页，共八十三页。一、研究(Jiu)背景和现状

陆栖微生物的代谢产物，已成为像抗生素这样生物活性物质的源泉。根据下列的理由，深信海洋微生物的代谢产物，也是希望之所在。第六十六页，共八十三页。一、研(Yan)究背景和现状(1)自然界里，微生物的种类和数量是明显地随着环境不同而改变。(2)微生物代谢产物的生产，会受所使用的培养条件调节。(3)已经知道许许多多生物活性物质是通过次级代谢而产生的，也因此将同时产生小量其他的相关物质。如果引进更敏感的测定方法来检测；更有效的的分离方法来纯化；更精密的方法来分析，将能得到新生物活性化合物，即使其在发酵液里含量甚少。第六十七页，共八十三页。一、研究背景和(He)现状(4)已经知道大多数生物活性化合物的产生是菌株特异的，而不是分类学上种属特异的。因此，可以直接培养分离到的菌株以取得新生物活性化合物，而无须先进行菌株分类。

(5)要成功地发现新的生物活性物质，用于分离微生物菌株的样品的采集是一个重要环节。近来，样品采集的设计已为发现新生物活性化合物作出了重大贡献。最近，已实现通过肉眼观察，采集深海海底的样品。(6)最近开发的在不减压的情况下分离和培养嗜压微生物的方法和设备，将对新微生物的生物活性产物的研究作出贡献。第六十八页，共八十三页。二、海洋微生物的生活(Huo)习性

及其多样性

1、耐盐性：一般地讲，海洋细菌的盐耐受性使最适宜生长于含2%~4%的培养基。从放线菌来说，大多数海洋链霉菌比陆栖链霉菌有较广的盐而受性(1%~7%NaCl)，尽管有一些对小于1%的NaCl仍敏感，和另一些能而受大于7%NaCl。由此可见，某些链霉菌的先祖可能来自陆地。第六十九页，共八十三页。二、海洋微生物的生活习性(Xing)

及其多样性(Xing)2、耐压性：静压力是深海的很重要的环境参数。只有那些嗜压和耐压的细菌才能在深海的高静压下生存。第七十页，共八十三页。二、海洋微生物的生活(Huo)习性

及其多样性3、寄生性：一些完全适应了海洋寄生、处于寄主体内微环境中的海洋微生物完全可能发展了非钠依赖的其它特性。

第七十一页，共八十三页。海洋微生物的种(Zhong)类关于海洋微生物的种类，目前还无法做出准确的判断。只知道海洋中的微生物种类可能约为陆生微生物的20倍以上。其中的土著海洋微生物与外来微生物的比例同样不清楚。第七十二页，共八十三页。开发(Fa)海洋微生物资源的意义①

海洋丰富的微生物资源为新药发现提供了多样的物种基础，它的开发将使人类进一步认识自然；②

新抗生素由于结构与作用机制可能有别于陆生来源的抗生素，将极大地克服目前的抗药性，同时为新药的合成提供新的“母核”；③

微生物易于培养、发酵，可无限再生而无需过度开采野生资源，经济和社会价值较大。第七十三页，共八十三页。三、海洋微生物活性成分的(De)研究及药物的(De)开发1、抗生素类物质；2、抗肿瘤类物质；3、其他生理活性物质；4、酶；5、毒素等。第七十四页，共