第三章 应用微生物学技术课件

现代微生物学技术第三章应用微生物学技术

第三章应用微生物学技术本章内容第一节微生物的接种与培养技术第二节微生物菌种的筛选与分离技术第三节微生物的菌种保藏技术第四节显微镜技术第五节免疫标记技术第三章应用微生物学技术3.1微生物的接种与培养技术一、微生物接种技术

微生物接种就是将一定量的纯种微生物转移到另一新鲜培养基中的过程。这是进行微生物实验时最重要的基本操作之一，要求在严格的无菌条件下进行。接种工具：接种针、接种环、接种铲、玻璃涂棒、滴管和移液管等接种方法：试管斜面接种、液体接种、穿刺接种和平板接种等第三章应用微生物学技术二、微生物的培养技术一）固体表面培养

固体表面培养是指微生物菌落生长在固体培养基的表面或里面的培养方法，该培养方法广泛用于培养好气性微生物的菌落形态观察、保藏、分离和细胞计数等。表面培养法培养微生物有下列特点：1、细胞多半是重叠地生长繁殖，因此直接与培养基相接触的细胞和在此细胞上再生长出的细胞会有所不同。2、从摄取营养的角度来看，上面的细胞就得通过下面的细胞或细胞间隙来获得营养。3、从供氧方面来说，从上到下逐渐形成缺氧的环境。第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术二）液体深层培养

液体深层培养是指用液体培养厌氧性微生物和好气性微生物的方法，培养厌氧性微生物不需搅动培养基，而培养好气性微生物则要搅动培养液，搅动方式有振荡，机械搅拌或通气搅拌。

第三章应用微生物学技术液体培养法有：1、振荡培养用于培养细菌、酵母菌及藻类等单细胞微生物，得到均一的细胞悬浊液，培养真菌或放线菌一类菌丝状细胞，则可得到糊状的培养物，如果振荡不充分，培养物的粘度又高，会形成许多小球状的菌团培养物。设备：箱式恒温振荡器、往复式振荡床（摇床）培养器：试管、三角烧瓶第三章应用微生物学技术HZQ-X100恒温双层振荡培养箱DZ-360超大型振荡器第三章应用微生物学技术2、通气培养一般是用玻璃制成的圆筒状的容器，主要部件有发酵罐主体、温度调节系统、搅拌系统、空气过滤系统、空气流量计以及各种检测仪表。通气培养设备具有如下优点：1）可以大量生产微生物细胞和代谢产物；2）根据需要可随时调节氧的供给速率、营养物的流加量、温度以及pH等；3）可直接观察发酵罐中的培养物以及培养液的变化情况，给研究工作带来方便。第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术三）厌氧培养厌氧培养是指在无氧的条件下进行微生物的发酵培养，可采用的原理有两个方面：一是除去培养容器中的氧气；二是增强培养基的还原能力。厌氧培养的方法很多，较普遍的有：1、在培养基中加入可溶性的还原性化合物；如葡萄糖、半胱氮酸、甲酸钠、硫代羟乙酸（HSCH2COOH）和它的盐等，以增强培养基的还原能力。2、用惰性气体或还原性气体完全代替空气；如以N2、H2、CO2取代空气。3、利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气；焦性没食子酸在碱性条件下可与氧结合生成焦性没食子素。第三章应用微生物学技术碳酸氢钠氢硼化钠第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术四）同步培养

同步培养主要是为了使培养液中的全部细胞能处于同一生长阶段（即同时进行分裂、生长、分裂）而设计的培养方法，即同步培养。获得同步生长细胞的方法有二种：1、选择法：选择法是通过过滤、密度梯度离心、膜吸附和直接选择等方法，从细胞群落中选择仅处于某生长阶段的细胞来进行培养的方法。第三章应用微生物学技术2、诱导法：诱导法是通过改变细胞群落的环境条件，如交替的温度变化、营养变化、使用能够影响细胞生长周期的主要代谢抑制剂，从而使同一培养容器中的全部细胞都处于同一个生长阶段。1）温度法：短时间低温处理，特异性地阻止细胞分裂，再恢复最适分裂温度获得同步温度培养物。2）饥饿法：通过除去培养基中的葡萄糖、氨基酸、胸腺嘧啶等营养源进行培养而获得同步培养物。一般是在少量的营养中使微生物进行对数增殖，使营养耗尽，然后再转入适宜的培养条件。第三章应用微生物学技术五）微生物的连续培养

当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，于是形成了连续生长。微生物以连续生长方式进行的培养称为连续培养第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术六）透析培养

透析培养是用透析膜隔开的相邻两液相间，一面由透析膜调节物质转移，除去了有害物质的积累；另一面进行微生物培养的方法，可提高细胞浓度。透析培养的特点：1、延长了发酵的对数增殖期，使菌体细胞的密度增加，为提高目的物产量创造了有利条件。2、消除终产物的反馈抑制，使酶活力增强，代谢功能旺盛。

第三章应用微生物学技术3.2微生物菌种的筛选与分离技术

选育菌种可以从以下方面着手：1、根据新的要求与微生物本身遗传变化的关系，从原有菌株入手进行各种遗传改造工作（诱变、基因改造）。2、根据文献资料报导的微生物种属，向国内外菌种保藏机构索取同种或同属的菌株，从中寻求符合要求者。3、根据所需菌种的特性，嗜好或工艺要求，从特定的生态环境中以特定方法重新分离自然菌株。第三章应用微生物学技术一、采样

自然界中蕴藏着大量的微生物，微生物资源异常丰富。土壤是微生物的大本营，据报道，1g土壤中约栖息1亿个细菌，1000万个放线菌，100万个真菌，55万个藻类。样品的初步分离：样品稀释接种第三章应用微生物学技术二、微生物的培养分离（选择培养分离）没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中所有微生物生长的要求，因为不同的微生物都自己特定的营养、生理、生长条件，这就为分离纯化微生物的提供了条件。选择培养分离的方法有：1、控制营养成分营养成主要指碳、氮、无机盐类及维生素等，各种微生物对这些物质的要求是有差异的。分离培养可根据要分离菌种的特性，改变上述培养基的碳、氮源和无机盐，从而分离到所需的菌种。如，Ashby无氮培养基（富集固氮菌）甘露醇1%,磷酸二氢钾0.02%,硫酸镁0.02%,氯化钠0.02%,硫酸钙0.01%,碳酸钙0.5%第三章应用微生物学技术2、控制培养基酸碱度

各种微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。细菌为pH7.0-8.0；放线菌为pH7.5-8.5；酵母菌为pH3.8-6.0；霉菌为pH4.0-5.8；3、控制培养温度和热处理

不同种类的微生物所适宜的生长温度是不同的，利用不同培养温度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。

第三章应用微生物学技术4、添加抑制剂添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的。如：培养基中加入数滴10%酚可抑制霉菌和细菌的生长，放线菌仍生长；培养基中添加青霉素、链霉素之类抗生素能抑制细菌的生长；培养基中加入胆盐抑制G+菌和非肠道G－菌的生长；培养基中加入10%乙醇可抑制细菌和霉菌的生长。

5、对供氧控制

通过提供好氧和厌氧条件来选择目的微生物。第三章应用微生物学技术三、微生物的分离纯化

由于微生物在自然界是混杂存在的，进行分离纯化培养是微生物学研究的基础

培养物(culture)在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称培养物。（如：斜面培养物） 纯培养物(pureculture)只有一种微生物的培养物称为纯培养物。由于微生物体体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，所以纯培养是研究微生物的前提条件。第三章应用微生物学技术一）无菌技术

无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染的技术被称为无菌技术。无菌技术包括：1、微生生物培养器具的灭菌

可采用干热和湿热法对玻璃器皿灭菌。

2、接种操作将微生物从一个培养器皿中转接到另一个培养器皿中，必须在无菌条件下进行，这是微生物学中最常用的基本操作。条件：在无菌室、超净工作台、火焰上进行操作3、培养①常用棉花塞塞口，或各种金属、塑料及硅胶帽塞口；只让空气通过，而空气中的微生物不能通过。②平皿培养；由正反两平面板互扣而成。 第三章应用微生物学技术二）固体培养基分离纯培养

为了取得所需微生物的纯种，必须进行平板分离。平板纯种分离的方法常用的有：1、稀释倒平板法

该法特点：①菌落分布均匀；②获得纯种的机率很大，常用于菌落计数；③会使一些不耐热的微生物死去；④位于培养基内的好氧微生物生长受到影响。因此还可用下面的方法进行微生物菌种的分离。2、涂布平板法

该法特点：①适于不耐热和好氧菌的分离；①菌落分布均匀差

第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术3、平板划线分离

该法特点：

简单，经数次平板划线可得纯化菌。4、稀释摇管法

该法特点：适于对氧敏感的厌氧菌的分离。

第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术三）液体培养基分离纯培养

有些微生物需要用液体培养基分离才能很地分离获得纯培养物，如原生动物、藻类等。液体培养基分离纯化法是采用稀释法。将待分离样液经一系列10倍稀释取0.1ml各稀释度液放入液体培养基试管内370C培养，48小时观察试管中菌的生长情况要想获得纯培养物，一稀释度样液需平行多个试管，经培养后有绝大多数（95％）试管不生长方可将生长的试管做为纯培养物。该法特点：适于不易在固体培养基上形成菌落的微生物分离。第三章应用微生物学技术四）单细胞（单孢子）分离

单细胞（单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。常用的仪器有：解剖显微镜（可对较大的细胞操作）、显微操作仪（可对较小的细胞操作）五）组织分离法：

适于高等真菌或高等生物病原菌的分离六）菌丝尖端切割本法适用于长菌丝的霉菌，使用无菌解剖刀切割菌落边缘的菌丝尖端，并移种到合适的培养基上培养了新菌落。

第三章应用微生物学技术四、微生物菌种的性能鉴定技术为了有效地进行筛选，必须一次或多次从现有菌群中，把多数无用的微生物淘汰掉，把少量的有用微生物筛选分离出来。菌种的性能鉴定方法的选择应做到：①快速：要尽快预测或预见出所筛选的目的微生物；②敏捷：迅速处理好众多的样品；③经济：通过一次筛选要得到具有广泛目标的有用微生物。为提高性能鉴定工作效率，常选用平皿特异反应检出法。第三章应用微生物学技术1、透明圈法

透明圈法是利用能使混浊的底物被分解后形成透明圈的大小，检出微生物利用或消耗此物质的能力。碳酸钙混在培养基中，可由透明圈的产生和大小确定微生物的产酸能力。含酪素的培养基可由透明圈法选取出蛋白酶产生菌等。第三章应用微生物学技术2、变色圈法

变色圈法是直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，或喷洒已生长菌落的培养基表面，使其形成显色圈而被检出。可溶性淀粉的培养基可加碘着色观察透明圈分辨产淀粉酶产生菌等。

pH指示剂检测微生物产物中是否含有机酸或胺（酸或碱）。第三章应用微生物学技术3、生长圈法

生长圈法是利用某些具有特殊营养要求的微生物为工具菌，若分离的微生物能在一般的培养条件下（缺乏上述营养要求物质）生长而合成该营养物，或生长后分泌某种酶能使该营养物的某种前体物质转化形成该物质，则能使工具菌生长，形成环绕具有此性能的菌落的生长圈。这种方法常用于氨基酸、核苷酸、维生素等产生菌株的选取育，使用的工具菌是对应的营养缺陷型菌株。工具菌和[-]培养基点植待分离菌产生工具菌所需的生长因子工具菌在其周围生长第三章应用微生物学技术4、抑制圈法

抑制圈法是由被分离菌分泌产生某些具有抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶水解无毒物质成为对工具菌生长有毒性的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑制圈。敏感工具菌涂布于平板将已生长待鉴定菌琼脂块贴于平板上（或用无菌滤纸片浸有待鉴定菌培养液贴于平板上）培养1-4天，观察抑菌圈大小。经过初筛的微生物，一旦找出具有发酵产物潜势的菌群，应立即按常规方法进行菌种保藏以备进一步检测。

第三章应用微生物学技术抑菌圈第三章应用微生物学技术敏感工具菌第三章应用微生物学技术抗生素产生菌的筛选法第三章应用微生物学技术五、微生物的复筛经过性能鉴定已初步确定了具有某种能力的菌株，再通过复筛可从中进一步选出那些对工业化生产有真正价值的微生物。筛选出的微生物经过初筛的性能鉴定、再经生产菌株的性状试验、抗菌试验以后，要用液体培养基做摇瓶培养、小型发酵罐培养、以及产物抽提试验等的复筛。

第三章应用微生物学技术一）微生物的鉴定确定微生物种类至少要确定它们属于哪个属、哪个种，这是一个重要环节，可把新分离出来的微生物与文献上的记载对照比较。分类可以让人们知道该微生物菌株对植物、动物或人是否有致病性。第三章应用微生物学技术二）发酵培养基成分的选择当一个新的菌株分离出来以后，还要经过发酵和培养试验对发酵条件进行一系列试验以后，找出最适合的工艺条件，才能把所筛选出的新菌株用于工业生产。

培养基是微生物生长的基础，也是目的产物的合成条件，因此培养基的组成对菌株的生产能力有非常重要的影响。通常可供选择的组分：碳源：葡萄糖、、蔗糖、淀粉、纤维素（特殊）等，加入量1%—5%氮源：黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母浸膏等，加入量0.1%—1%无机盐：氯化物、硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾等，加入量0.01—0.05%

另外还需要进行最适pH值的的选择第三章应用微生物学技术三）培养与发酵

一个新的菌株被分离出来后，经过分离纯化，然后进行试验室规模的培养与发酵，经逐步放大最后进入工业化生产。其程序是：1、摇瓶培养

常以250或多或500ml锥形瓶在200r.p.m旋转摇床上培养，主要用于培养基和培养条件的筛选。2、玻璃自控发酵罐

玻璃发酵罐是从摇床向发酵罐的过渡阶段，一般容量在5—50L，主要用于工艺条件，工艺参数的选择和考察，。3、试验罐培养

是中间工业试验阶段，一般容量为1—5T。主要目的是放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规律和发酵参数，工业规模生产打下坚实基础，第三章应用微生物学技术六、发酵产物的提取试验先把菌丝体和发酵液分离开来，再分别进行提取试验，菌丝体用水或溶媒抽提。发酵液可经过溶媒抽提、活性碳吸附、树脂吸附等途径进行抽提试验。然后根据代谢产物的生物活性，抗菌活性等检定结果，确定提取的途径和工艺。第三章应用微生物学技术七、发酵产物的检测和鉴别1、紫外线吸收光谱的测定2、抗菌谱的测定3、层析分离检测鉴定4、电泳分离检测鉴定第三章应用微生物学技术3.3微生物的菌种保藏技术经分离纯化得到的微生物纯培养物是很珍贵的资源，所以要进行微生物菌种的保藏。保藏的目的：①使菌种在一定时间内不死亡；②不会被其他微生物污染；③不会因发生变异而丢失重要的生物学性状；保藏的条件：使菌株的代谢水平降低，及至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态。因此常用干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等。保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）、中国典型培养物保藏中心（CCTCC）、美国典型菌种保藏中心（ATCC）、美国北部地区研究实验室（NRRL）、荷兰霉菌中心保藏所（CBS）、英国国家典型菌种保藏中心（NCTC）、日本大阪发酵研究所（IFO）、世界菌保藏联合会（WFGC）。第三章应用微生物学技术一、传代培养（定期移植）保藏法该法包括斜面培养、液体培养、穿刺培养等。具体方法是将菌种接种于所要求的培养基上，置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在50C左右，湿度70%以下的条件下保藏。在保藏期间，要定期移植，每隔3－6个月移入新的培养基中，培养后继续保藏。优点：1、是操作比较简单，不需要特殊设备；2、使用方便；能够随时接种以便复试和观察所保存的菌株是否死亡、变异、退化或污染等。缺点：1、保藏时间短；3—6个月。2、菌株经过反复传代，易发生变异；生理活性、形成子实体的能力等容易减退。适用于：各类微生物菌株的保藏。 第三章应用微生物学技术二、石蜡油封保藏法

此法是在长好菌苔的小斜面试管中，加入灭过菌的矿油（液体石蜡）。这种方法是从定期移植保藏法变通的方法，该法优于优越于传代培养保藏。1、将化学纯的液体石蜡分装试管中，在1210C加压灭菌1小时，再经1100C干燥1小时，主要是为了除掉加压灭菌后侵入的石蜡油中的水分。2、将灭菌的石蜡油注入长好菌苔的小斜面试管中，液面高出斜面1cm。3、封入石蜡油后，试管应直立保存在4—100C冰箱中或放于低温干燥处。优点：1、防止培养基中水分的蒸发和传代培养菌种的干燥死亡；2、石蜡油层限制氧的供应而抑制或减弱菌的代谢，这样便可推迟细胞老化；3、保藏方法简便，不需特别装置；4、保藏时间较长；1—5年；缺点：存活率不高，约30—70%适用于：酵母、某些好气细菌和孢子形成能力特别弱的丝状菌。第三章应用微生物学技术三、砂土管保藏法

1、无菌砂士的制备：取细砂过40-60目筛，放入玻璃容器中，用10%盐酸处理2小时，水洗至中性，烘干或晒干。取肥沃园土过100目筛，将细土与砂按1：2混合，分装入安瓿管内约2cm高，加棉塞，1210C30分钟，灭菌三次。2、菌悬液的制备：将菌苔已长好的斜面，注入无菌水3-5ml，用接种环轻轻将菌苔刮下，使成菌悬液。3、取1ml菌液加入已冷却的砂土管内混合，然后将砂土管放在装有干燥剂的真空干燥器中，接通真空泵，抽干（一般4-6小时，砂土成粉散状），熔封，置5-80C冰箱内保藏。优点：1、真空干燥，彻底隔绝了水分和空气；2、简单方便；3、保藏时间较长；为1-10年缺点：只限于产孢子微生物。适用于：产孢子的微生物，如产芽孢的细菌、放线菌和霉菌等。第三章应用微生物学技术四、冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法是目前比较好的一种菌种保藏方法，是在减压条件下，将冷冻状态的菌体或孢子悬殊液进行真空干燥。操作要点：1、准备安瓿管；1210C灭菌30min。2、准备保护剂；20%脱脂乳粉液，1160C灭菌15-20min。

3、制备菌悬液；在斜面试管加入保护剂2-5ml，制成菌悬液。4、分装菌悬液：0.2ml/安瓿管。5、冷冻真空干燥；预冻到-450C左右，真空度达到0.01-0.001mmHg即可。

6、熔封；7、检验和保藏；高频电火花枪检验真空度，4-100C冰箱内保藏。优点：1、可较长期保藏；5-15年，不易发生变异。2、适用于大多数微生物缺点：设备要求较复杂。适用于：对各类微生物如大多数细菌、放线菌、霉菌、酵母以及病毒都具有良好的保存效果。除了只产生菌丝体的担子菌等外。第三章应用微生物学技术五、液态氮超低温保藏法液氮保藏法是微生物在-1500C以的低温下，所有的代谢活动暂时停止。操作要点：1、准备安瓿管；2、制备保护剂；10%二甲亚砜和10%甘油等。3、制备菌悬液；菌种接入到无菌保护剂中，使之形成菌体悬液。4、分装：0.2ml/安瓿。5、熔封；6、冻结；降10C/min，待降至-400C立即放入液氮中快速成冻结保存。7、保藏；气相温度为-1500C，液相为-1960C，为避安瓿管炸裂，气相保藏。8、恢复培养；置于38-400C水浴中，振荡，直到全部融化为止

优点：1、操作简单；2、适用于所有微生物；3、菌种可长期保藏；缺点：设备要求复杂，成本高。适用于：

所有微生物，菌丝也可制成悬液，或直接用琼脂块保藏。第三章应用微生物学技术3.4显微镜技术

1590年荷兰的Hans父子创造了放大10倍的原始显微镜，显微镜的发明距今已有四百余年。现已成为细胞生物学研究的主要工具。随着科学技术与光学理论的发展，具有其它功能的各种显微镜，如相差显微、暗视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等也相继问世。近代已制成显微分光光度计。这是一种显微镜与分光装置联合的仪器，既能观察细胞内的微细结构做到定位，又能定性和定量地测细胞内各种组成成分，因此能对细胞和组织内的某些化学物质进行定量分析。总之，由于显微镜技术的发展使我们对细胞的结构了解得更清楚，尤其是在超微结构（如内质网、叶绿体体）和分子结构方面，从而使人们对细胞的认识水平又进入了一个新的境界。第三章应用微生物学技术3．4．1光学显微镜技术

一、光学显微镜的结构原理1、结构光学系统：目镜、物镜、聚光镜显微镜结构机械系统：载物台、镜筒、转换器、调焦装置、镜座、镜臂

光学系统决定了显微镜质量的好坏。第三章应用微生物学技术二、显微镜的基本光学参数1、分辨力（ResolvingPower）

分辨力指能分辨清楚物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离，分辨距离越小，则分辨力越高，

分辨力（最大可分辨两点间距离）R=0.61λ/N.A.

λ：所用光线的波长

N.A.：数值孔径（亦称镜口率）

λ 可分辨两点间距离；N.A.可分辨两点间距离； 干燥系物镜的N.A.：10×：为0.25；40×：为0.65。油浸系物镜的N.A.：0.85-1.40。2、放大率(Magnification）

放大率是指眼睛看到像的大小与原物大小的比值。

M总=M目×M物

第三章应用微生物学技术3、焦点深度（DepthFocus）

焦点深度是指调焦看清楚标本的某一物点时，不仅这一点看清楚，此点的上下两侧也能看清楚的厚度。

d=kn/M总

N.A.(mm) k:为常数约0.24mmn:为介质折射率若:M=40×N.A.=0.25d=24μmM=700×N.A.=1.25d=0.24μm

焦点深度深（大）可保证观察到被检物体的全层，焦点深度浅（小）必须运用调焦装置从上到下观察物体的全层来弥补焦点深度浅的缺点。4、工作距离（WorkingDistance）

工作距离是指从物镜第一个镜片表面到盖玻片表面或标本表面之间的距离。

N.A. W.D. N.A.为0.40时W.D.为0.5mmN.A.为1.40时W.D.为0.1mm第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术3.4.2光学显微镜的种类一、明视场显微镜明视场镜检技术是以标本的颜色及其透射率为基础的显微观察，观察的标本都需染色处理才能有好的效果，是最常见的普通光学显微镜。第三章应用微生物学技术二、暗视场显微镜1、成像原理

1）使光线不直接通过聚光镜进入，而只能从聚光镜的周缘斜射到标本上，标本经斜射照明后，其反射光和衍射光进入物镜形成图像。结果显微镜视野黑暗，标本发亮，反差增大，可清楚看到样品。

2）在暗处当光线斜射到标本上，由于光的反射和衍射，使标本似乎增大体积而可辨认。2、结构1）光源

要求强光源，为500W直射光或弧光，将显微镜放在暗室中进行观察。

2）聚光镜3）物镜4）目镜3、应用①观察无色透明的活细胞，以及活细胞的运动状态。

②暗视场显微镜最适于观察微粒，可看到直径为0.002-0.004μm（普通显微镜仅能分辨0.2μm)以上的微粒。

第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术三、荧光显微镜1、原理物质在吸收短波长光波后可转换而发射出较长的光波，称为荧光。

荧光显微镜是以紫外线为光源来照射被检物体使之发出荧光，然后在显微镜下观察其形状及其所在位置。第三章应用微生物学技术产生荧光现象有两种：自发荧光是细胞内含有的某些天然物质经紫外线照射后发出荧光。如，植物细胞内叶绿体的叶绿素能发出血红色的荧光，木质部的木质素激发后产生黄色荧光。诱发荧光是细胞经荧光染色剂染色后，再经紫外线照射产生的荧光。常用的荧光色素有：金胺、酸性品红、甲基绿、中性红、刚果红、硫代黄色素、樱草素、吖啶橙、吖啶黄等。如，标本经固定后，用吖啶橙染色，可使细胞内RNA发出红色荧光，DNA发出绿色荧光。在DNA电泳中常用溴乙啶（EB）为染色剂，EB—DNA复合物在紫外检测仪下发出橙红色的荧光。第三章应用微生物学技术2、结构其结构与光学显微镜一样，但其特殊的结构主要有：1）光源利用紫外线作为光源，必须使用高压汞灯。2）激发荧光滤光片（蓝色）只充许紫外光（275—400nm）或蓝紫光（325—500nm）通过。3）物镜与普通光学显微镜一样。4）屏障滤光片（黄色）只充许激发产生的荧光（410—650nm）通过，而不让紫外光和蓝紫光通过，。5）目镜与普通光学显微镜一样。第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术注意事项：①高压汞灯打开后，需经10—15min才达到最大亮度。②制片要薄，太厚不易观察，深度的荧光物质不能被激发。③油浸用的油必须使用无荧光的液体石蜡或檀香木油等，香柏油本身产荧光。④一标区不宜连续观察3分钟以上，以免荧光猝灭。⑤镜检时，使用暗视野显微镜，让视野保持黑暗，可使荧光现象更加明显。⑥标本染色后，应当天观察，否则会褪色，或采用摄影记录保存。3、应用用以观察生物标本的固有荧光、染色剂荧光和免疫学荧光。第三章应用微生物学技术四、光学显微镜样品标本的制作技术1、细胞染色技术简单染色法革兰氏染色法正染色抗酸性染色法鉴别染色法芽孢染色法鞭毛染色法荧光染色法负染色：荚膜染色法等2、活体观察技术1）压滴法2）悬滴法3）插片法第三章应用微生物学技术3.4.3电子显微镜技术自1932年德国发明电子显微镜以来，发现了许多光学显微镜下看不到的新现象、新事实，开拓了超微世界，使得医学、生物学步入了分子生物学领域。目前电镜不仅可以观察一般细胞的超微结构，而且还可以探讨其分子结构；从一般超大型微细结构的定性观察，走向定量分析；从透射电镜超薄切片的平面观察，进入扫描电镜三维空间的立体表面观察、以及X线显微分析仪对微区进行的元素分析，这一些都由不同功能电子显微镜来完成。第三章应用微生物学技术一、透射电子显微镜一）原理1、利用电子束代替光束作为照明源并穿透样品。2、电子束的形成。电压V；电子流υ；波长λ；两点间距 ；当V为50-100kv时，λ为0.0054-0.0037nm可见范围为2埃-2.5埃,是光学显微的1000倍，肉眼的一百万倍。3、电子图像的形成当电子束照射到样品上时，会出现一列四种情况①一部分电子从样品原子与原子之间的空隙中穿透过去。②一部分电子穿透时，会与样品原子核或原子的轨道电子发生碰撞，被散射开来。③一部分电子从样品表面被反射出来。④一部分电子被样品吸收后，样品激化而又从样品本身反射出来（二次电子）。第三章应用微生物学技术

透射电镜收集的是透过样品的电子，这些电子束轰击荧光屏，在屏上现出光强差异的可见光图像。由于物体不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同。样品质量、厚度 ；散射电子能力 ；透过光栏孔的电子数目；打在荧光屏上像的亮度 ；反之亦然，因而出现了明暗反差。

4、电子图象的放大电子显微镜的放大率是由透镜决定的，而透镜是由看不见的电磁场构成，称为磁透镜。

电磁场强度；放大倍数；

第三章应用微生物学技术二）结构透射电镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三部分构成。1、电子光学系统

是电镜的主体，包括有：1）照明系统

为成像提供一个高亮度、高稳定、束斑直径可调的照明电子束。电子枪

为电子的发射源，50-120kV的高压电源，电子束径<100μm。聚光镜是将来自电子枪的电子束会聚于样品上，用它控制电子束斑的大小、照明强度和照明孔径角。控制电子斑束的直径<2μm。电子斑束直径；电流密度；像亮度；图像模糊不清。

第三章应用微生物学技术2）成像系统样品室位于聚光镜的下方，室内有样品台，样品台支承样品，使之在同一平面上纵向或横向移动。物镜

是由非磁性材料间隙的带铁壳的线圈和高导磁率材料制成的极靴所组成，当电流通过时就会产生电磁场。

中间镜

位于物镜下方。结构与物镜相似，将成像的图像进行放大。投影镜位于中间镜下方。结构与物镜相似，将物像再次放大，并将放大的图像投射到荧光屏上。第三章应用微生物学技术3）观察与记录系统观察室

位于投影镜的下方。包括：①荧光屏因为肉眼不能直接看到电子射线，故电子射线必须通过电子轰击涂有发光物质的荧光屏才能看到电子图像。荧光屏位于观察室内下方，观察者可以直接通过正面和侧面的铅玻璃（防止射线对观察者的危害）观察窗，观察荧光屏上的电子像。②双目镜在观察窗外还装有一架可放大5-10倍的双目光学显微镜可用来仔细观察荧光屏上的图像。照相机

可记录摄影电子图像。

第三章应用微生物学技术2、真空系统由于电子必须在真空中才能无阻挡地高速飞行，因此电镜成像系统必须保持一定的真空度。否则电镜不能正常工作。原因：①气体分子与高速电子碰撞产生随机散射电子，降低图像的反差。②气体分子存在，电子枪的高压会引起电离和放电，使电子束不稳定。③气体与炽热的灯丝作用，会腐蚀灯丝，缩短灯丝寿命。④残余气体会污染样品。在电子束的通道内不能有任何游离气体存在，真空度的好坏是影响电镜能否正常使用的关键。现在高性能的透射电镜，其照明和成像系统中，真空度可达8×10-6Pa

真空系统包括有：排气管道、开关阀门、真空规、真空指示表、真空干燥器、空气压缩机等。第三章应用微生物学技术3、供电系统电镜的供电系统比较复杂,它包括两个方面的作用;1）提供合适的电功率。包括高压、透镜电流和真空电源等高度稳定的工作电压与电流。2）调节和控制电镜的工作状态。包括一系列的控制调整线路。供电系统包括：灯丝加热电源、电子加速高压电源、透镜电源、真空电源、自动控制系统、束偏转、消像散器等电源以及安全系统和辅助电源。第三章应用微生物学技术第三章应用微生物学技术二、扫描电子显微镜扫描电子显微镜是上世纪60年代开始出现并迅速发展起来的一种大型精密光学仪器。在透射电镜中，照明电子束是透过样品后经物镜放大成像，而扫描电镜则以完全不同的方式成像，其照明电子束并不透过样品，而是在样品表面作光栅扫描运动，主要是用来观察物体的外表形貌。一）原理1、电子枪灯丝加热，射出直径约为20-35μm的电子束，。2、电子束受到1-40kV（透射电镜为100kV）的电压加速射向镜筒。3、电子束受到聚光镜和物镜的会聚作用，缩小成直径为几纳米的电子束照射到样品上。第三章应用微生物学技术4、扫描线圈使电子束在样品表面逐点逐行地扫描，当电子束打到样品上，会样品中激发多种电子信号，其中激发出样品浅表的二次电子能够产生样品表面的形貌特征像。二次电子的发射，是由于入射电子碰撞样品中原子的核外电子，核外电子获得能量脱离原子成为二次电子。其信号的强弱依样品表面的形状而异。5、由样品表面各点发出的二次电子，经加速器加速至10千伏左右，并射到由闪烁塑料光导管、光电倍增管等组成的探测器上，再经视频放大后，在显像管荧光屏上显示出来，便形成了一幅反映样品表面形貌的图像——二次电子像。在样品上任何一点上的二次电子的发射强度的变化，都将表现为在显像管荧光屏上对应点的亮度变化，从而反映出样品表面形貌特征的黑白电子像。第三章应用微生物学技术二）结构1、电子光学系统

电子枪

电子发生装置，但加速电压较低，在1-30kV。聚光镜

会聚电子束。物镜

会聚电子束。电子束经聚光镜和物镜的会聚作用于，缩小成直径为几个纳米的电子束照射到样品上。消像散线圈物镜中装有 扫描线圈：使电子束作扫描运动。 可变孔径光阑2、样品室

位于镜筒的底部，其空间很大，可以观察100mm的大样品，可移动范围大，样品台可通过机械手作前后、左右、上下、倾斜（±

900）和旋转（3600）

第三章应用微生物学技术3、信号检测与显示系统二次电子检测器

收集二次电子，并送至后面的光电倍增管。视频放大器

接收电信号，并放大。显像管

显示二次电子图像。4、照相机5、真空系统

在扫描电镜中也有一套真空排气系统。 6、供电系统第三章应用微生物学技术三）扫描电镜的特点 与透身镜相比，扫描电镜具有一些极有价值的特点1、能在很大的放大倍率范围工作几十倍几十万倍；样品全貌微细结构2、具有极大的焦深对复杂而粗糙的样品表面,仍可看到清晰聚焦的图像。3、样品的适应性大

无论金属、生物、化工、半导体或矿物材料，不认固体、粉末或液体，小至微生物、寄生虫卵；大者如昆虫，半导体芯片，甚至10cm3的样品皆可放到扫描电镜样品室中观察。4、操作方便样品与终像之间无透镜。5、样品制备较简单有些样品甚至可不经任何处理可直接放入样品室用扫描电镜观察。第三章应用微生物学技术三、透射电镜样品超薄切片技术由于电子穿透力很弱，即使观察细菌也无法见其内部结构，也只能观察到细菌的外貌及鞭毛，如要观察其内部结构则必需将细菌进行超薄切片，因此电镜标本的制作必须注意：1）标本必须十分干燥；常用脱水剂有乙醇、丙酮等。2）标本必须出现适合的密度差别，以便得到最高的形像对比；3）由于电子不能穿透玻璃，因此标本的支持物不能用载玻片和盖玻片；而是用火棉胶膜、聚乙烯甲醛（透明塑胶膜），铜网和镍网。 膜厚度<100-150埃金属网有孔，电子易透过4）标本厚度为10-100nm的薄片；除病毒外，微弱的电子束无法透过其它生物细胞的整体标本，需要制作成1000埃以下厚度的超薄切片，方能看清其内部的微细结构。第三章应用微生物学技术超薄切片的制作步骤：1、取材

从动植物机体上、细胞及微生物培养物中取行所需材料的过程叫取材。2、固定

用化学法或物理法迅速杀死细胞的过程叫固定。固定目的：是使细胞中各种细胞器及大分子尽可能真实地保持在生活状态，并牢固地固定在它原来的位置上，而且不会因一系列后继的处理使其移位或丢失。固定方法：①物理法：采用冰冻、微波照射、临界点干燥等手段来保存细胞结构。②化学法：有一定的化学试剂来固定细胞的结构，这些化学剂称固定剂。3、漂洗经固定后，样品必须用相应的缓冲液充分漂洗，洗去残留的固定剂。 第三章应用微生物学技术4、脱水脱水目的：将组织细胞内的游离水除去，以利于包埋剂均匀地渗透到组织与细胞内。由于常用的包埋剂是非水溶性的，只有将组织中游离水分彻底清除之后，非水溶性的包埋剂才能渗入。5、渗透与包埋渗透与包埋目的：是用包埋剂逐步渗入组织细胞内取代脱水剂，使细胞内外所有的空隙都被包埋剂填充，再将渗透好的组织块放入适当的模具中，灌满包埋剂包埋。6、聚合聚合目的：经加温使模具中的组织块被包埋剂聚合，使组织块成为硬度适当的包埋块，以便切出理想的超薄切片。第三章应用微生物学技术7、超薄切片 超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品，需要有专用的超薄切片机、切片刀和切片技术。8、电子染色

为了加大反差，要对生物样品进行染色，以增加电子散射能力，称为电子染色。染料为重金属盐类，如醋酸铀，柠檬酸铅等。

第三章应用微生物学技术电子染色原理电子染色是利用重金属盐能与细胞的某些结构成分相结合的原理进行的，经这些重金属化合物染色后，细胞的不同结构成分上吸附重金属原子的数量不同，因此出现三种不同的现象：结合重金属较多的区域（即结构致密的部位）具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子致密的黑色；结合重金属较少的区域，电子散射能力较弱，呈现浅黑色；没有结合重金属的区域是电子透明的区域。这样经过电子染色可提高样品的反差，增加图象的清晰度。常用的染色液：醋酸双氧铀、柠檬酸铅第三章应用微生物学技术四、扫描电镜样品制备技术扫描电镜主要是观察标本的表面结构或者组织细胞经过冷冻断裂的方法观察细胞内表面结构，不需要制作超薄切片，因此制备方法比较简单。制备用于扫描电镜观察的生物标本，主要有三个基本标准：

干燥的生物标本；具有良好的导电性能；标本的微细结构维持原形；为此，目前应用的标本制备过程如下：标本→洗净→脱水→干燥→表面导电处理→观察固定：戊二醛、锇酸等脱水：丙酮、乙醇等干燥：冷冻干燥法、临界点干燥法等表面导电处理：金、铂喷镀、碘化钾-醋酸铅等导电染色第三章应用微生物学技术3.5免疫标记技术3.5.1免疫酶标记技术一、原理

免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼，光学显微镜和电子显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。第三章应用微生物学技术免疫酶技术是一项先进的免疫化学测定技术，由于具有：①灵敏度高，特异性强；②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于诊断；③仪器和试剂来源广，价格低廉；④操作简单，重复性好；⑤可用于定位成分分析；第三章应用微生物学技术二、免疫酶技术基本条件免疫酶技术的应用成功与否取决于：1、抗原和高特异性、高效价的抗体2、用于免疫酶技术的酶应具备：1）高纯度，高催化性，高专一性；2）酶蛋白分子具有足够的偶用标记基团，与抗原、抗体蛋白分子偶联处理后，仍保持较高的催化活力。3）使用稳定性和保存稳定性好。4）测定酶活力的方法要求简便、灵敏、快速。5）酶的来源、纯化和供应方便，价格低廉。第三章应用微生物学技术3、酶与抗体的偶联4、酶底物必须具备的条件：1）易于获得，价格低廉。2）配备方便，贮存稳定。3）显色鲜明。与相应酶的反应，能生成肉眼可明显观察到的颜色改变。4