基因工程工具酶

基因工程常用工具酶限制性内切酶DNA连接酶DNA聚合酶修饰酶1基因工程工具酶5/8/2024限制性内切酶1、发现历史2、分类和命名3、Ⅱ型核酸内切酶基本特征4、酶切反应要点5、双酶切的技巧2基因工程工具酶5/8/2024核酸酶的分类

内切酶

──非专一性──外切酶

核酸酶─内切酶

──RNA─

外切酶

———专一性─非限制性──内切酶─

限制性──DNA───外切酶

3基因工程工具酶5/8/2024限制性内切酶的类型基因工程中最常用的是Ⅱ型酶4基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型酶的命名、书写规则1、前三个字母用斜体，其他用正体表示。2、前三个字母来自于产生该酶的微生物的拉丁名，其中，第1个为属名的第一个字母，后两个为种名的前两个字母。3、如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号；4、名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。（示例）5基因工程工具酶5/8/2024

限制酶来源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCPstI Providenciastuartii164

CTGCA↓G6基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型核酸内切酶基本特征1、每一种酶都有各自特异的识别序列。

(1)

序列不同

(2)长度不同：4－7bp(3)但与DNA来源无关2、识别序列一般具有回文结构。

5’

G↓AATTC3’3’CTTAA↑G5’3.切割后,产物的特点

（1）5’－pi,3’—OH

（2）平端粘端－－都是5’

突出或都是3’

突出（3）粘端可重新通过氢键配对4.特殊性质

7基因工程工具酶5/8/2024EcoR1切割8基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型核酸内切酶的特殊性质1、同位酶：

识别相同序列，但切割位点不一样的酶(如SmaI和XmaI)2、同尾酶:

识别位点不同，但切割出相同的末端序列（BamHI和BclI)；3、同裂酶：

识别位点和切割位点都相同的酶（HpaI和HincⅡ)；4、甲基化的调节：

MspI(所有）和HpaⅡ(非甲基化）5、Star活性（星号活性）：在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。6、位置效应

酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同（侧翼序列太短无法切）9基因工程工具酶5/8/2024酶切反应要点1.温度:一般37°C,特殊25°C(SmaI)2.对Na+要求不一样分成3类:【低盐（0)】【中盐（50mM】【高盐（100mM)】3、尽量使反应体积最小,但酶的用量不超过总体积的10%(甘油抑制酶活)4.决不能用水稀释,以免变性失活。5.先配好其它试剂，最后才加酶；6.取酶立即放于冰上，用完后立即放入－20°C。7.使用无菌的新枪头。10基因工程工具酶5/8/2024双酶切的技巧

1、两种酶buf不一样

(1)选通用buf(2)先用(低盐buf+E低)反应,后补高盐buf+E高反应；

2.两种酶反应温度不一样：（1）先(E1+T1)反应,后（E2＋T2）反应；

3.E1结果影响E2反应：

(1)先加E2反应,后加E1反应11基因工程工具酶5/8/2024连接酶(DNAligase)1.作用原理2用途3.操作要点12基因工程工具酶5/8/2024连接酶的作用原理在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA

中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。13基因工程工具酶5/8/202414基因工程工具酶5/8/2024FunctionofT4DNAligase(1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口(2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口；用途：(1)通过粘端连接DNA分子；(2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接头的连接。15基因工程工具酶5/8/2024连接酶操作要点T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃,因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用16℃（4-16℃）。DNAconcentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体Time:O/Nbetter平端连接:加大酶量16基因工程工具酶5/8/2024DNA聚合酶Taq酶Klenow酶反转录酶末端转移酶17基因工程工具酶5/8/2024Taq酶耐热DNA聚合酶:94℃能较长时间保持活性,最适温度72℃;方向:5’3’底物:模板+引物+dNTP(还需Mg2+)反应速度:1kb/min不同种类的Taq酶功能不同.用途:(1)PCR(2)sequence(3)TAclone18基因工程工具酶5/8/2024Klenow酶特点:DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段(被枯草杆菌蛋白酶切割)MW＝76kD5`→3`聚合酶活性(合成)4.3`→5`外切酶活性(矫正)用途:DNA探针的标记2.平端化:补平3’凹端或切除3’凸端19基因工程工具酶5/8/2024反转录酶(reversetranscriptase)两种:

AMV(来源于鸟类肿瘤病毒)--------42℃反应

M.MLV(来源于鼠白血病毒)-------37℃反应主要特点:(1)RNADNA（√）

(2)DNADNA(3)外切RNA(4)不具有纠错功能用途：

(1)mRNA转录成cDNA(2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针

20基因工程工具酶5/8/2024末端转移酶(terminaltransferase)1.取自小牛胸腺2.催化脱氧核苷酸与DNA的3`-OH结合引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或带有突出的双链DNA。不要求模板。3.两种反应：

Mn2+

或Mg2+ssDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppiCo2+dsDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi4、用途：加一个同源多聚物，便于未知序列的操作。21基因工程工具酶5/8/2024修饰酶1、T4多核苷酸激酶2、碱性磷酸化酶3、核酸酶

(1)核酸酶Bal31(2)核酸外切酶Ⅲ(3)单链核酸酶S14、DNA甲基化化酶

22基因工程工具酶5/8/2024T4多核苷酸激酶(Kinase)

作用原理：催化ATP的γ－Pi转移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化。用途：放射性标记DNA链的5‘末端，探针标记注意：（1）铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。（2）低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。（3）该酶很难纯化,酶制品经常不纯。23基因工程工具酶5/8/2024碱性磷酸化酶作用原理：切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5‘磷酸基团,变成5’OH。来源：（1）细菌碱性磷酸酶(BAP)：BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。（2）牛小肠碱性磷酸酶(CIP)：除去CIP可用蛋白酶K降解用途：（1）从DNA片段上除去5‘磷酸以防自身连接。（2）在放射性标记DNA5‘末端前，除去磷酸。

24基因工程工具酶5/8/2024核酸酶Bal31具两种活性：(1)双链特异外切酶活性；从dsDNA的3`和5`切除寡核苷酸或单核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸)可终止反应(2)单链特异内切酶活性：专门从单链DNA切除带有5`末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核酸酶S1的单链特异性核酸内切酶活性)

Ca2+Ca2+

25基因工程工具酶5/8/2024

Ca2+

用途：1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子变小，在T4连接酶的作用下连接接头和载体。2.绘制DNA的限制图谱。

Bal31与限制性内切酶协同作用可绘制物理图谱.还可逐步缩短DNA片断，使之适合构建嵌合质粒。Bal31de内切酶活性已用于检测致癌剂与突变剂引起的DNA双链损伤2