酶的分离工程

酶的分离工程第四章酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化：将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开而获得所要求的酶制品的过程。第2页,共113页，2024年2月25日，星期天思考题：思考题1.名词解释：酶的抽提、离子交换层析、凝胶层析、凝胶电泳、酶的结晶2.酶分离纯化的特点、基本环节有哪些？3如何根据酶的性质选择分离纯化方法4写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。

5细胞破碎的目的、方法及原理。

6酶抽提的目标、方法及影响因素。。第3页,共113页，2024年2月25日，星期天思考题7.酶液制备的过程有哪些？8.说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。9.酶的结晶方法有哪些？10.分析说明酶分离纯化的应用第4页,共113页，2024年2月25日，星期天[教学目的]

了解酶的分离纯化方法；掌握酶生产、研究的重要环节：酶的分离流程与各单元操作的原理。[重点与难点]1、如何运用本章所学对蛋白质的酶学性质（如分子质量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）进行研究。2、如何耦合与集成酶分离工程的单元操作。[课堂教学设计]

图示以讲清复杂的原理，生产科研实例与理论相结合。[教学时数]5学时第5页,共113页，2024年2月25日，星期天生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。第6页,共113页，2024年2月25日，星期天作业题1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举例说明。2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什么？3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析在原理、操作(装柱、过柱）及应用方面的异同点。第7页,共113页，2024年2月25日，星期天作业题4.比较说明用于酶层析分离的层析介质应该具有的共性和个性：它们是吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。5.用于表明酶纯度的是哪种电泳？用于制备的是哪种电泳？原理？第8页,共113页，2024年2月25日，星期天作业题6.等密度梯度离心、层析聚焦与等电聚焦电泳有何异同？7.离子交换纤维素为什么较离子交换树脂更常用于酶等大分子物质的分离？第9页,共113页，2024年2月25日，星期天酶的分离纯化策略一原则二方法选择三纯化策略四纯见检定第10页,共113页，2024年2月25日，星期天应注意的问题：一、防止酶的变性失活

1.低温操作

2.控制pH

3.减少泡沫形成

4.防重金属、有机溶剂、微生物污染

5．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基二、选择有效的纯化方法三、酶活性测定贯穿纯化过程的始终。第11页,共113页，2024年2月25日，星期天酶分离纯化的一般步骤:层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎（机械破碎、溶涨和自溶、酶解、化学处理）有效成分的抽提生物组织→→提取液→

→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理第12页,共113页，2024年2月25日，星期天第一节酶溶液的制备（前处理）把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液。酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽提液的浓缩等几个步骤。第13页,共113页，2024年2月25日，星期天一、材料预处理及细胞破碎（一）材料预处理酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（游离酶和膜结合酶）。微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥；胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取；动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等；植物材料应避免单宁等物质着色污染。第14页,共113页，2024年2月25日，星期天

不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同。（二）细胞破碎1、机械破碎法2、物理破碎法3、化学破碎法4、酶促破碎法第15页,共113页，2024年2月25日，星期天1）捣碎法利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽等材料的破碎。

2）研磨法利用研钵、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。助磨剂：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝工业：高速珠磨机（High-speedbeadmill）如：Dyno-mill球磨机第16页,共113页，2024年2月25日，星期天3）匀浆法（homogenization）利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器的研杵的磨球和玻璃管内壁之间间隙常保持在十分之几毫米距离。破碎细胞的程度比组织捣碎机高。大型细胞破碎器：Manton-Gaulin匀浆器主要是高压下使细胞通过小孔隙而被挤碎，每小时可处理数十升至数千升样品，适用于微生物发酵工业生产。对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法丝状真菌、较小的G+菌不宜用此法第17页,共113页，2024年2月25日，星期天1）压力差破碎法高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）2）温度差破碎法反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎.

3）超声波破碎法（Ultrasonication）

杆菌比球菌容易破碎

G-比G+容易破碎酵母菌不易破碎第18页,共113页，2024年2月25日，星期天1）渗透作用：将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来；2）自溶：向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；3）表面活性剂：膜结合的酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。3、化学破碎法第19页,共113页，2024年2月25日，星期天lysozyme、protease、cellulase、zymolyase

价格高，通用性差，产物抑制的存在用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放。4、酶促破碎法（Enzymaticlysis）第20页,共113页，2024年2月25日，星期天（一）酶提取的方法（二）影响酶提取的主要因素二、酶的提取大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐，稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。第21页,共113页，2024年2月25日，星期天1、盐溶液提取一般采用稀盐溶液进行酶的提取，浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。常采用等渗溶液，即0.125mol/LNaCl和0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸缓冲液或0.1mol/LTris-HCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA（1~5mmol/L）、巯基乙醇（3~20mmol/L）等。例：酵母醇脱氢酶用0.5mol/LNa2HPO4溶液提取。6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取。枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。第22页,共113页，2024年2月25日，星期天2、酸溶液提取例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取3、碱溶液提取例：细菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的碱溶液提取。pH值与酶的稳定性相关，选择pH不能超出酶的稳定范围，从抽提效果而言pH值要偏离目的酶等电点，也就是说酶如果是酸性蛋白质则宜用稀碱溶液来抽提，反之碱性蛋白用酸来抽提。第23页,共113页，2024年2月25日，星期天4、有机溶剂提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取。

如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性。例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用丁醇提取，都取得良好效果。第24页,共113页，2024年2月25日，星期天影响酶提取的主要因素1、温度为防止变性失活,制备具有活性的酶,提取温度一般不易过高，一般在0℃~10℃的低温操作.

但如果抽提的酶比较稳定也可以用高温。如胃蛋白酶可以在37℃抽提。第25页,共113页，2024年2月25日，星期天2、pH值酶的溶解度和稳定性与pH值有关.首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择pH4-6为宜。提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内,为了提高酶的溶解度，提取时pH值应避开酶的等电点。第26页,共113页，2024年2月25日，星期天3、提取液的体积一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提取。4、辅助因子：在提取操作时适当加入底物或辅酶成分，可以改变提高酶的稳定性。为了防止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺酰氟）；为防止氧化，则加入半胱氨酸或巯基乙醇。第27页,共113页，2024年2月25日，星期天5、其他含酶原料颗粒大小、搅拌、提取时间。搅拌能促使被提取物的溶解,一般采用温和搅拌为宜,速度太快容易产生大量泡沫,增大了与空气的接触面,会引起酶等物质的变性失活.因为第28页,共113页，2024年2月25日，星期天三、酶溶液的絮凝、净化与脱色（一）絮凝发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困难。通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片和杂蛋白、粘多糖、核酸以及脂类等大分子物质去除。无机（如醋酸钙和磷酸钙等），有机（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如壳多糖等）第29页,共113页，2024年2月25日，星期天（二）过滤或离心净化

1、离心分离——从细胞抽提物中除掉固体离心机的选择：工业：连续流动离心机、间歇卸料的圆盘式离心机2、过滤——从细胞抽提物中除掉固体涡流膜过滤法（cross-flowmembranefiltration）第30页,共113页，2024年2月25日，星期天3、双水相萃取适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶。（1）原理：利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统

开始于20世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、病毒等分离提纯。第31页,共113页，2024年2月25日，星期天双水相萃取技术双水相萃取技术((Two-aqueousphaseextraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离第32页,共113页，2024年2月25日，星期天各种双水相系统聚合物P聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖甲基纤维素羧甲基葡聚糖、葡聚糖（Dex）乙基羟乙基纤维素羟丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸钠、酒石酸钾钠第33页,共113页，2024年2月25日，星期天（2）影响酶在两相中分配系数的因素1）两相的组成2）高分子聚合物的分子量、浓度、极性等3）两相溶液的比例4）酶的分子量、电荷、极性等5）温度、pH值等第34页,共113页，2024年2月25日，星期天（3）双水相萃取技术的优点双水相体系为酶的溶解和抽提提供了适宜环境，而且处理容量大。设备简单。操作方便、快速、条件温和。不需处理就可与后续提纯步骤相衔接。第35页,共113页，2024年2月25日，星期天几种典型的双水相萃取酶蛋白实例酶菌种相系统延胡索酸酶BrevibacteriumspPEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐

-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶BacillussphaericusPEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐第36页,共113页，2024年2月25日，星期天（三）脱色

酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。第37页,共113页，2024年2月25日，星期天四、酶溶液的浓缩冷冻干燥法：先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。蒸发法：目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。第38页,共113页，2024年2月25日，星期天超过滤法：将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。胶过滤法：利用SephadexG-250或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。其它方法：吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。干燥：将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥第39页,共113页，2024年2月25日，星期天分离工程概念及步骤分离与提纯从生物反应器中排出的反应产物是一种混合物，里面除含有目的产品外，还含有未转化的基质、不能转化的物质、大量的水、微生物体及各种微量杂质。为了获得合格的生化产品，并且不浪费其他有用的物质，必须对需要的生化产品进行分离或提纯。这一过程称之为“下游加工”，这样可以使其他物质循环使用或再进行综合利用，既降低了成本又保护了环境。第40页,共113页，2024年2月25日，星期天分离工程概念及步骤1．固体物质的去除分离生化反应液的细胞或其他固体物质，是提取生化产品的重要一步。分离过程是基于它们的粒度、密度、溶解度和扩散度等的不同实现的，分离的粒度范围为0.3~10μm。为了提高分离效率要进行预处理，以促进细胞的絮凝。常用的去除固体的分离方法是过滤、离心分离、沉降及倾析等。第41页,共113页，2024年2月25日，星期天分离工程概念及步骤2．初步分离当从反应器出来的反应液除去了不需要的固体颗粒后，一般要进一步把溶液浓缩，以提高目的产品在溶液中的浓度。为了实现这一过程，可以使用蒸发、萃取、沉淀和膜分离等单元操作。如膜分离技术是一种新型的分离技术，近年来发展很快。它是用一种半透明的薄膜，使溶液中的某些组分通过，其他组分被阻止或截留，从而达到分离的目的。它包括反渗透法和超滤法。膜分离法不同于萃取和沉淀法那样，需要加入溶剂或盐类等其他物质，也不同于蒸发操作，需要加入热量，膜分离法只是根据物质粒度的大小这一几何特性的差异，来分离物质，因此产品的损失很少，产率和质量较高。第42页,共113页，2024年2月25日，星期天分离工程概念及步骤3．产品提纯产品提纯的目的主要是去除溶液中的各种微量杂质，进一步提高产物的纯度。常用的方法有沉淀法、层析法和吸附法。但是生物产品的提纯，更多用的是层析法。层析法有吸附层析法、离子交换层析法、分子筛层析法和亲和层析法等，根据不同被分离物的特性，选择不同的层析分离方法。第43页,共113页，2024年2月25日，星期天分离工程概念及步骤4．产品的最终分离最后一步必须使产品达到规定的质量指标，以适合销售市场的要求。主要的单元操作是先离心分离，然后进行干燥或冷冻干燥等。干燥操作往往是生物产品的最后工序，其目的是除去物料中的水分，便于产品的保藏和运输。由于很多的生物产品，如味精、柠檬酸、酶制剂、抗生素及单细胞蛋白等均是固体产品，因此干燥操作在生物产品的最终分离方面十分重要。第44页,共113页，2024年2月25日，星期天我国在工业生物技术的上游领域（细胞工程、基因工程等领域）和世界先进水平差距较小，在某些方面甚至处于领先水平，但在工业生物技术的过程科学基础研究方面与国外有较大的差距，尤其是过程放大原理和方法。我国生物技术新产品的转化能力差，缺少有自主知识产权的产品中试、放大技术平台，不能迅速把实验室成果转化为工业产品，致使我国许多工业生物过程与发达国家相比普遍存在能耗高、资源综合利用率低、环境污染严重、产品质量差、工业放大周期长等问题，例如：我国较国外先进水平工业原料利用率低10-20％，产品回收率低5-15％，而能量消耗高20-30％，操作方式粗放，排污严重。至今我国的大型工业生物过程依然主要依赖国外技术。第45页,共113页，2024年2月25日，星期天第二节酶分离纯化的基本过程一、酶分离纯化方法的选择

目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的。在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。第46页,共113页，2024年2月25日，星期天评价分离纯化方法优劣的3个指标

回收率：纯化后样品的总酶活占纯化前样品总酶活的百分比；总活力；比活力提高的倍数及重现性：比活力：特定条件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数。比活力提高的倍数：纯化后/纯化前样品比活力第47页,共113页，2024年2月25日，星期天快速有效的检测方法是前提酶活力：最重要，全程。蛋白质纯度；杂质分析。第48页,共113页，2024年2月25日，星期天表d长春花中Strictosidine合成酶的提纯

步骤总蛋白（毫克）比活性*nKat/毫克蛋白总活力单位（nKat）产率%提纯倍数（Ⅰ）粗抽提液（Ⅱ）硫酸铵沉淀（Ⅲ）DEAE-纤维素柱（Ⅳ）羟基磷灰石柱（Ⅴ）SephadexG-75（Ⅵ）等电聚焦65446638．75．90．720．080．0080．0110．100．642．85．95．25．13．93．82．00．5100987573381011．312．580350737．5第49页,共113页，2024年2月25日，星期天思考题

1.

细胞破碎的目的、方法及原理。2.

酶抽提的目标及方法。3.

相对离心力、沉降系数及三种离心方法的特点。4.

常用沉淀法的种类及原理。5.

常用沉淀法的种类及原理。盐析法分离蛋白质的原理、种类及盐析常数的含义。第50页,共113页，2024年2月25日，星期天思考题6.

双水相萃取、超临界流体萃取、反胶团萃取的原理。7.

膜分离的种类、原理及应用。8.

比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析在原理、层析介质、操作及应用方面的异同点。9.

HPLC的产生特点及反向色谱的含义及分离依据。10.

比较连续与非连续、变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区别。第51页,共113页，2024年2月25日，星期天思考题11.

结晶与沉淀的区别及酶结晶的条件及操作。12.

蛋白质浓度测定方法及酶活力测定方法。13.

比活力、提纯倍数、回收率的含义及用途。14.

总结脱盐、浓缩、分子量测定的方法及原理。15.

等电聚焦的原理与用途。16.

亲和层析的原理是什么？如何根据目的产物的性质选择洗脱方式？17.

电泳的基本原理是什么？电泳的种类有哪些？18.

SDS和等电聚焦电泳的原理和操作的不同之处是什么？19.

影响凝胶过滤分辨率的因素有哪些？分配系数的含义及作用。第52页,共113页，2024年2月25日，星期天性质方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷电泳、离子交换层析吸附性质吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）对配体分子亲和层析的生物亲和力一、酶分离纯化方法的选择第53页,共113页，2024年2月25日，星期天性质方法规模大小或质量离心大/小凝胶过滤小膜分离（透析、超滤）小电荷离子交换色谱大/小电泳小等电聚焦小溶解度改变pH值大改变离子强度大/小降低介电常数大特殊结合位置亲和色谱小亲和洗脱大/小第54页,共113页，2024年2月25日，星期天二、根据溶解度建立的分离方法（层淀分离）1、盐析(SaltingOut)法

最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数V=V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。第55页,共113页，2024年2月25日，星期天⑴基本原理

有机溶剂对于许多蛋白质(酶),核酸,多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用,是较早使用的沉淀方法之一.其原理主要是:

①降低水溶液的介电常数,导致蛋白质溶解度降低而沉淀.（F=Q1Q2/εr2

）

②由于使用的有机溶剂与水互溶,它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子,破坏了蛋白质分子的水膜,因而发生沉淀作用.2、有机溶剂沉淀法常用：乙醇,甲醇和丙酮.第56页,共113页，2024年2月25日，星期天①分辨能力比盐析法高,即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀.

②沉淀不用脱盐,过滤比较容易(如有必要,可用透析袋脱有机溶剂).因而在生化制备中有广泛的应用.

有机溶剂沉淀法的优点是:

有机溶剂沉淀法的缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活,操作需在低温下进行.第57页,共113页，2024年2月25日，星期天

1)温度:酶在有机溶剂中对温度特别敏感,温度稍高就会引起变性,且有机溶剂与水混合时产生放热反应,因此有机溶剂必须预冷,操作要在冰盐浴中进行.一般都要在低温下进行（0℃±1℃）2)样品浓度:低浓度样品回收率低,要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀.高浓度样品,可以节省有机溶剂,减少变性的危险,但杂蛋白的共沉淀作用大.

选择适当的蛋白质浓度才能达到较好的分离效果。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜.

有机溶剂沉淀的影响因素第58页,共113页，2024年2月25日，星期天3)pH值:选择在样品稳定的pH值范围内,通常是选在等电点附近,从而提高此沉淀法的分辨能力.

4)离子强度:通常盐浓度以不超过5%为宜,使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的2倍体积为宜,

中性盐的加入能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并能防止蛋白质变性，一般采用0.05mol/L以下的稀盐溶液。沉淀所得的固体样品,如果不是立即溶解进行下一步的分离,则应尽可能抽干沉淀,减少其中有机溶剂的含量,如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂,以免影响样品的生物活性.

第59页,共113页，2024年2月25日，星期天3、等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性,通过调节溶液的值，使酶或杂质沉淀析出，从而实现酶与杂质分离的方法.可以利用此法进行初步的沉淀分离.

第60页,共113页，2024年2月25日，星期天由于许多蛋白质的等电点十分接近,而且带有水膜的酶等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉淀析出,因此,单独使用此法分辨率较低,因而此法常与盐析法,有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用,以提高沉淀能力和分离效果.

此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白,而不用于沉淀目的物.

第61页,共113页，2024年2月25日，星期天4、复合沉淀法常用的复合沉淀剂有：聚乙二醇、聚丙烯酸、单宁如聚丙烯酸（PAA）可以与某些碱性酶蛋白，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：

PAA+酶PAA-酶

PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAA第62页,共113页，2024年2月25日，星期天5、选择性变性沉淀法热变性、有机溶剂变性和pH变性α-淀粉酶——热变性红细胞酶——乙醇-氯仿第63页,共113页，2024年2月25日，星期天三、根据分子大小建立的分离纯化方法这类方法包括透析，超过滤，离心以及凝胶过滤等。1、透析(Dialysis)法：原理：透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。第64页,共113页，2024年2月25日，星期天Matricesusedforchromatography第65页,共113页，2024年2月25日，星期天Proteinpurificationbychromatography第66页,共113页，2024年2月25日，星期天透析袋的预处理：(1)将透析管剪成适当长度(10-20cm)的小段，即形成透析袋。(2)在大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10min。(3)将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。(4)将透析袋置1mmol/LEDTA(pH8.0)中煮沸10min。(5)待透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。

注：从此步起用透析袋时一定要戴手套操作。(6)在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。第67页,共113页，2024年2月25日，星期天透析（dialysis）透析袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器常用的透析袋类型：

再生纤维素膜透析袋纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（

1102Da）；商品名为spectrapor等。过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；第68页,共113页，2024年2月25日，星期天原理：利用压力、抽滤或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，强行使水和其它小分子溶质通过膜，而所需的酶分子被滤膜截留，以达到浓缩和脱盐目的。2、超过滤(Ultrafiltration)法抽气滤膜离心加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液滤膜第69页,共113页，2024年2月25日，星期天超过滤（ultrafiltration）为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。制备超滤膜的材料：多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数：截留分子量、耐受压力、滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有AmiconDiaflo系列等。

超滤器类型：有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。第70页,共113页，2024年2月25日，星期天（1）离心机的选择3、离心分离第71页,共113页，2024年2月25日，星期天Cellfractionationbycentrifugation

第72页,共113页，2024年2月25日，星期天1）常速离心机又称低速离心机最大转速：8000r/min相对离心力（颗粒所受的离心力与地心引力之比)：＜1×104g主要用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣等固形物及粗结晶等较大的颗粒。RCF=1.12×10-5×r×n2

r=旋转半径（厘米）n=每分钟转数第73页,共113页，2024年2月25日，星期天2）高速离心机转速：1×104－2.5×104r/min相对离心力（RCF）：1×104－10×105g主要用途：分离各种沉淀物、细胞碎片、较大的细胞器等高速冷冻离心机第74页,共113页，2024年2月25日，星期天第75页,共113页，2024年2月25日，星期天3）超速离心机转速：2.5×104－12×104r/min相对离心力：5×105g主要用途：分离DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化。超速离心机的精密相当高。为了防止样品液流出，一般附有离心帽；为了防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统；为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。此外还有一系列安全保护系统、制动系统及指示仪表等。第76页,共113页，2024年2月25日，星期天第77页,共113页，2024年2月25日，星期天原理：采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在大离心力的条件下进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同沉降速度的颗粒分批分离出来。常用于分离大小和密度相差较大的颗粒。1）差速离心法（2）离心方法的选用第78页,共113页，2024年2月25日，星期天2）密度梯度离心（densitygradientcentrifugal）原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。滴加样品离心管蔗糖密度梯度蔗糖浓度每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。第79页,共113页，2024年2月25日，星期天velocitysedimentationvs.equilibriumsedimentation第80页,共113页，2024年2月25日，星期天梯度介质选择标准：应具有足够大的溶解度，以形成所需的密度梯度范围；不与样品中的组分发生反应；不会引起样品中组分的凝集、变性或失活。常用介质：蔗糖、甘油蔗糖：浓度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm2第81页,共113页，2024年2月25日，星期天4、凝胶过滤法原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。第82页,共113页，2024年2月25日，星期天返回第83页,共113页，2024年2月25日，星期天返回第84页,共113页，2024年2月25日，星期天第85页,共113页，2024年2月25日，星期天葡聚糖凝胶SephadexG:是

有SephadexG-10~G-200共8种型号；G后面的数字是表示不同的交联度，数字越大，交联度越小，吸水量越大，其数值越为吸水量的10倍；pH稳定范围为2-11；分子量分级范围为~8105；亲水性强。凝胶的类型与选择：Sephadex葡聚糖凝胶第86页,共113页，2024年2月25日，星期天Sephacryl凝胶聚丙烯酰胺葡聚糖SephacrylS：

有SephacrylS-100HR~S-100HR共6个型号；机械性能，分辨率，分离速度，化学稳定性均高于葡聚糖凝胶；可用0.5mol/LNaOH在位清洗；中性时可以高压灭菌；对所有常用的缓冲液均稳定；pH稳定范围3-11；有效分子量分离范围1103~2107或>108。第87页,共113页，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP：有Bio-GelP2~Bio-GelP300共10个型号；P后面的数字乘以1000表示其分离的最大分子量（排阻分子量）；过酸或过碱时不稳定；在pH5.5-6.5时可以高压灭菌；在大多数缓冲液中都可使用；pH稳定范围为2-10；分级范围为1102~6104。

琼脂糖凝胶:有Sepharose,Superose和

Bio-GelA三种，每种又有各种不同的型号；凝胶的孔径大小是通过琼脂糖浓度来控制的；分级范围很宽；但对温度要求严格（2-30℃），40℃以上时易融化，低于0℃时易堵塞。第88页,共113页，2024年2月25日，星期天Sepharose琼脂糖凝胶第89页,共113页，2024年2月25日，星期天四、按蛋白质电荷性质设计的分离方法（一）吸附法（吸附交换分离法）根据吸附机制的不同可分为3种：物理吸附法，羟基磷灰石法和离子交换吸附法。是利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的；操作方式有静态吸附和柱层析两种方式。操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样吸附，洗涤和洗脱。第90页,共113页，2024年2月25日，星期天常用的吸附剂有硅藻土，活性氧化铝，淀粉和活性炭等。预先洗涤和活化后，在低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱碱条件下进行洗脱。常采用静态方式进行。1、物理吸附法：第91页,共113页，2024年2月25日，星期天羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。2、羟基磷灰石法第92页,共113页，2024年2月25日，星期天利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。离子交换剂：一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组成。根据高分子支持介质的性质可以将离子交换剂分为3种类型：离子交换树脂，离子交换纤维素和离子交换球型多糖(如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等)。3、离子交换吸附法（离子交换色谱法）第93页,共113页，2024年2月25日，星期天返回第94页,共113页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂是一种特殊网状结构的高分子化合物，其母体原料是一些不溶性的交联聚苯乙烯等，活性基团通过化学反应连在母体上。离子交换纤维素是目前酶分离纯化中应用最广泛的一种离子交换剂；是在纤维素母体上引入功能基团组成的。离子交换球型多糖以交联葡聚糖或交联琼脂糖为母体，引入功能基团而成的。第95页,共113页，2024年2月25日，星期天强酸型(硝酸基)阳离子交换剂弱酸型(羧基)阳离子交换剂强碱型(季胺盐)阴离子交换剂弱碱型(伯胺基)阴离子交换剂等。根据离子交换基所带电荷性质和解离状况可以分为：第96页,共113页，2024年2月25日，星期天离子交换剂类型的选择：应考虑以下几个因素：参考电泳结果：在中性或偏碱性条件下进行电泳，向阳极移动较快的酶，可选用阴离子交换剂；向阴极移动较快的酶可被阳离子交换剂吸附。待分离酶的稳定性：待分离酶如果在低于pI的条件下稳定，则选用阳离子交换剂；待分离酶如果在高于pI的条件下稳定，则选用阴离子交换剂。待分离酶的pI：pI<6时选用强碱型阴离子交换剂；pI>9时选用强酸型阳离子交换剂；pI在6-9之间选用强型弱型均可。（3）离子交换层析的操作过程：包括离子交换剂的预处理及平衡，装柱，加样吸附，洗脱，洗脱液收集及检测，离子交换剂的再生。第97页,共113页，2024年2月25日，星期天（二）电泳法在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。第98页,共113页，2024年2月25日，星期天膜电泳：以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。粉末电泳：