药物毒理学讲座

药物毒理学讲座内容提要

●概述

●药品临床前毒性试验

●药效试验研究的基本要求

●药效学试验举例

第2页,共126页，2024年2月25日，星期天一、概述

(一)实验设计

(designofexperiment,DOE)

良好的设计是顺利进行科学研究和数据统计分析的先决条件，也是获得预期结果的重要保证。第3页,共126页，2024年2月25日，星期天设计包括专业设计和统计设计两部分：

专业设计是从各专业角度考虑实验的科学安排，是基础。包括选题，建立假说，确定研究对象和技术方法等；

统计设计则是从统计学角度，考虑设计的科学性和逻辑性，使研究结果具有重现性，更可靠，更科学，经得起时间的考验。第4页,共126页，2024年2月25日，星期天(二)医学科学研究种类

●临床研究

●流行病学研究

●动物实验研究第5页,共126页，2024年2月25日，星期天(三)研究深度广度层次●

整体→系统→器官→组织

→细胞→亚细胞→分子水平●

个体群体●

体外

体内●

宏观微观第6页,共126页，2024年2月25日，星期天(四)医学科学研究的基础学科和方法学

●卫生统计学

●流行病学

●卫生毒理学第7页,共126页，2024年2月25日，星期天

(五)毒理学及其相关术语

1.

毒理学(toxicology)

是研究化学物质对机体的生物学作用及其机理的学科；

研究化学物质对机体的有益作用，即通过影响机体器官的生理功能或细胞代谢活动达到防治疾病的目的，属药物学范畴；

研究化学物质对机体的有害作

用及其防护措施，属预防医学范畴。第8页,共126页，2024年2月25日，星期天

2.外源化学物(xenobiotics)：

以前叫外来化合物，指存在于人类生活的外界环境中、可能与机体接触并进入机体的化学物质；它们并非人体的组成成分，也非人体所需的营养物质，也不是维持正常生理功能和生命所必需的物质，但可由外界环境经一定环节和途径与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用。确切地说，应称为“外来生物活性物质”。须强调：包括“药物”。第9页,共126页，2024年2月25日，星期天外源化学物包括：

医药

农药

工业化学物

环境污染物

食品添加剂

产业性化学物：如化妆品、洗涤剂等

与外源化学物相对应的概念是内源活性化合物：指机体代谢过程中所形成的产物或中间产物。第10页,共126页，2024年2月25日，星期天3.

毒物(poison)

指在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂时或永久性的病理改变，甚至危及生命的化学物质。

“毒物”与“非毒物”的概念是相对的。第11页,共126页，2024年2月25日，星期天

4.毒性(toxicity)化学物能够对机体造成损害的能力，称为毒性。

在同等剂量下，化学物质对机体损害能力越大，其毒性越高。相对于同一损害指标，需要剂量越小的化学物质，其毒性越大。第12页,共126页，2024年2月25日，星期天如同“毒物”和“非毒物”是相对的一样，化学物质的毒性高低具有相对意义。

对于毒性，一定要强调“量”的概念。任何化学物质，只要达到一定的剂量，对机体都具有毒性，而低于某一剂量水平时，则不具有毒性。

如人体必需的微量元素Se、食盐等；

毒性大的非人体必需化学物，在某一剂量范围内对机体不呈现损害作用，有的反而对某种疾病有治疗作用，如As、Pb。

因此，剂量(dose)是化学物质毒性的决定因素。第13页,共126页，2024年2月25日，星期天化学物质的毒性除主要取决于剂量外，还与化学物对机体的作用条件(如接触途径、接触方式：包括接触次数、时间、间隔等)、理化特性(如溶解度、分散度、挥发度、比重、硬度)、环境因素(如气温、气湿)、宿主因素(如物种、品系、性别、年龄、遗传素质、免疫水平、健康状况、营养状况)等有关。

因此，探讨化学物对机体的生物学作用，关键是作用剂量和作用条件。即在严格控制条件下通过实验研究(动物实验)观察药物对机体及其组成部分的作用规律及其原理。第14页,共126页，2024年2月25日，星期天★

5.半数致死剂量

(medianletheldose,LD50)，或半数致死浓度(LC50)：指化学毒物能够引起受试对象死亡一半所需要的剂量或浓度。又称致死中量。为一统计量。

毒物的毒性大小，通常用动物急性毒性试验所得出的LD50或LC50来表示。化学毒物的急性毒性与LD50呈反比，即急性毒性越大，LD50的数值越小。

经口、经皮毒性用LD50表示，单位mg/kg·BW)；

吸入毒性或对水生动物的毒性用LC50表示，单位mg/m3或mg/L。第15页,共126页，2024年2月25日，星期天

LD50或LC50是评价化学毒物急性毒性大小最重要的参数，也是对不同化学毒物进行急性毒性分级的基础标准。我国农药的急性毒性分级级别经口LD50(mg/kg·WB)经皮LD50(mg/kg·WB)4h吸入LC50(mg/m3)2h剧毒＜5＜20＜20高毒5~20~20~中等毒50~500200~2000200~2000低毒＞500＞2000＞2000第16页,共126页，2024年2月25日，星期天化学物质急性毒性分级级别大鼠口服LD50(mg/kg·WB)相当于人的致死剂量(mg/kg·WB)(g/人)极毒＜1稍尝0.05剧毒1~50500~40000.5中等毒51~5004000~300005低毒501~500030000~25000050实际无毒5001500000500无毒＞15000＞5000002500第17页,共126页，2024年2月25日，星期天反映化学物质急性毒性大小的指标还有：

最大无作用剂量(NOEL)；

最小有作用剂量(minimaleffctlevel，MEL)，又叫中毒阈剂量(thresholddose)

，或中毒阈值，或毒性阈值；

最大耐受剂量(maximaltolerancedose,MTD,LD0)

最小致死剂量(LD1)；

绝对致死剂量(LD100)。

第18页,共126页，2024年2月25日，星期天

6.剂量—反应关系(dose-responserelationship)表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系。

7.

剂量—效应关系(dose-effectrelationship)表示化学毒物的剂量与个体

或群体中发生的量效应强度

之间的关系。第19页,共126页，2024年2月25日，星期天

安全系数种属差异,动物实验,外推到人。

试验组不同剂量组

阴性对照组

阳性对照组为何设阴性、阳性对照组？

样本含量原则：既符合统计学要求,又不致人力、物力、财力、时间的浪费。

统计学处理计量资料;计数资料第20页,共126页，2024年2月25日，星期天医药药效学农药研究产业性化学物毒理学(五)

药物研究●药效学研究●毒理学研究两者均须通过动物实验、流行病学、临床研究方法进行研究，但毒理学研究主要采用动物实验。第21页,共126页，2024年2月25日，星期天(六)

毒理学安全性评价

我国现有的毒理学安全性评价程序：

《食品安全性毒理学评价程序》

《农药安全性毒理学评价程序》

《新药(农药)毒理学研究指导原则》

《化妆品安全性毒理学评价程序》

《化学品毒性鉴定管理规范》(入世为与国际接轨颁布)

实验室研究质量规范(goodlaboratorypractice,GLP)，对毒性鉴定机构的认证、实验室要求作出明确规定。第22页,共126页，2024年2月25日，星期天对不同化学品(食品添加剂、药物、农药、化妆品、工业化学物等)，由于接触方式、途径、剂量不同，按照不同的国家标准，采用不同行业规范程序进行评价。第23页,共126页，2024年2月25日，星期天毒理学安全性评采用分阶段试验的原则(考虑急性危害、慢性危害、远期危害)。各阶段试验之间有关联，要按顺序进行。

如急性毒性实验是所有毒理学实验的基础；

慢性毒性实验的剂量、观察指标的选择要参考亚慢性毒性实验的结果。

根据前一阶段的实验结果，判断是否进行下一阶段的实验。第24页,共126页，2024年2月25日，星期天

不同阶段的毒理学试验项目

我国现有毒理学评价程序多数为4个阶段。《化妆品安全性毒理学评价程序》为5个阶段。

新药研究分为全身用药的毒性试验、局部用药的毒性试验、特殊毒理研究，三部分。

化学物的种类不同，用途不同，试验方法和先后顺序不同(如化妆品、食品，口皮急毒顺序不同)。第25页,共126页，2024年2月25日，星期天

第一阶段，包括：

♫

急性毒性试验；

♫

局部毒性试验。

目的：主要是测定LD50或LC50，并进行急性毒性分级，为其它试验提供剂量参考依据，并推测靶器官。

农药、化装品要进行

♫

皮肤、黏膜刺激试验；

♫

眼刺激试验；

♫

皮肤致敏试验；

♫

皮肤光毒试验；

♫

光变态反应试验。第26页,共126页，2024年2月25日，星期天第二阶段，一般包括：

♫

蓄积试验；

♫

致突变试验。

目的：了解与受试物多次接触后体内的蓄积情况以及可能的危害，并判断是否具有致突变性进而估计致癌性。

蓄积试验，以死亡为指标，有一定局限性，目前有些评价程序已经去掉。

致突变试验，包括多种组合，以观察不同的遗传终点。第27页,共126页，2024年2月25日，星期天某些受试物在第一、第二阶段试验后，可决定是否进行下一阶段的试验。

如引进产品、生产工艺，国外已经登记注册，毒性资料全面，其质量规格、生产工艺、与国外产品一致，进行第一阶段和第二阶段结果与国外一致，可以不进行第三、第四阶段试验。第28页,共126页，2024年2月25日，星期天

第三阶段，包括：

♫亚慢性毒性试验；

♫生殖及发育毒性试验；

♫代谢试验。

亚慢性毒性试验目的：确定反复接触受试物所引起的毒性效应、强度、靶器官，初步估计NOAEL或LOAEL，为慢性毒性试验和致癌试验提供剂量、指标参考依据。

生殖发育毒性试验包括：致畸试验；繁殖试验。目的：观察对生殖过程的影响。

代谢试验目的：了解受试物在体内的吸收、分布、消除情况，判断蓄积性。第29页,共126页，2024年2月25日，星期天

第四阶段，包括：

♫慢性毒性试验；

♫致癌试验。

目的：获得NOAEL或LOAEL，

为制订卫生标准提供参考数据。

特点：时间长、费人力物力。第30页,共126页，2024年2月25日，星期天

(七)药物毒理学研究的发展

随着医学科学和医药工业的进步和发展，研制和开发了大量新药，对医治人类疾病,保障人类健康起到了巨大作用。

但由于1961年反应停(thalidomide)药害事件发生，使28国家中出生了8000多短肢畸形儿，引起世界各国极大关注，使医学界首次认识到对母体安全的化学药物对胎儿产生不可逆损伤。由此揭开药物和其它环境化学毒物致畸的研究序幕。人们在要求药效的同时，更注意其安全性。第31页,共126页，2024年2月25日，星期天一种药物的药理概况，决定于临床前的药理和毒性研究，在供使用前必需了解预期药效、药理性质、毒性作用，有助于显示其使用安全性。药物的安全性，是保证药品质量的重要环节，随着新药的国际化，国际间相互利用安全性试验数据也日益增加。第32页,共126页，2024年2月25日，星期天为此，英国1968年颁布药品法，1971年成立了药物检定机构和药物安全委员会。此后，在药物市场经济推动下，许多发达国家开始重视药物和其它化学品对人类生殖的影响，首先是致畸性(teratogenicity)，WHO于1967年在国际疾病分类中把先天缺陷列为第14项，分20大类、133小类。同时，研究怀孕至出生之间胚胎/胎儿异常发育的畸胎学(teratology)创立。1981年OECD(经济合作和发展组织)制定了“化学物质毒性试验指导原则”，该指导原则不仅对药品也包括一般产业性化学物质，使毒性试验规范化。第33页,共126页，2024年2月25日，星期天第34页,共126页，2024年2月25日，星期天第35页,共126页，2024年2月25日，星期天第36页,共126页，2024年2月25日，星期天第37页,共126页，2024年2月25日，星期天

(七)新药研究过程

大致可分三步：即临床前研究、临床研究和售后调研。

1.临床前研究

用动物试验进行系统药理研究和急慢性毒理观察，对于具有选择性药理效应的药物，在进行临床试验前，还需测定该药物在动物体内的吸收、分布及消除过程(药代动力学)，故临床前研究目的是弄清新药的作用谱(药效)及可能发生的毒性反应(毒作用特点)。第38页,共126页，2024年2月25日，星期天

2.临床研究

首先从10～30名志愿者中找出安全剂量(依据动物试验结果，安全系数)，再选有特异特征病人随机分组，设立已知有效药物及空白安慰剂双重对照(阳、阴性对照),对治疗结果统计分析，判断其疗效。

3.售后调研

重点了解长期使用后出现的不良反应和远期疗效(流行病学研究)。第39页,共126页，2024年2月25日，星期天(八)新药药理毒理研究的技术要求

新药的药理毒理研究包括主要药效学、一般药理学、药代动力学及毒理学研究等。第40页,共126页，2024年2月25日，星期天新药的药效研究，以医药理论为指导，运用现代科学方法，制定具有医药特点的试验方案，根据新药的功能主治，选用或建立相应的动物模型和试验方法，其目的是对新药的有效性评价提供科学依据。

新药的毒理研究包括急性毒性、长期毒性和特殊毒性试验等，其目的是对新药的安全性评价提供科学依据。第41页,共126页，2024年2月25日，星期天

基本要求

1.试验主要负责人应具有药理毒理专业高级技术职称和有较高的理论水平、工作经验与资历。确保试验设计合理，数据可靠，结果可信，结论判断准确。试验报告应有试验负责人签字及单位盖章。

2.受试药物应处方固定、制备工艺及质量基本稳定。

3.从事新药安全性研究的实验室应符合国家药品监督管理局《药品非临床研究质量管理规范》(GLP)的要求，药理研究也可参照实行。第42页,共126页，2024年2月25日，星期天

全身性用药的毒理试验

1．急性毒性试验

观察一次给药后，动物产生的毒性反应并测定其半数致死量(LD50)。

要用两种以上给药途径(包括推荐临床研究的给药途径，溶于水的药应当测定iv的LD50)。给药后至少观察7d，观察到动物有毒性反应时应进行肉眼尸检，记录所有病变。存活24h或更长时间的处理动物，当尸检发现有病变组织时，应对该组织进行镜检。第43页,共126页，2024年2月25日，星期天

2．长期毒性试验

观察动物因连续用药而产生的毒性反应、中毒时首先出现的症状及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况。第44页,共126页，2024年2月25日，星期天

(1)动物：至少两种动物(包括啮齿类和非啮齿类)，啮齿类常用大白鼠，年龄为6W，饲养观察1W后使用，动物数按毒性试验时间的长短决定，如毒性试验时间＜90d，每剂量组为雌雄各10只。如毒性试验时间＞90d，每剂量组为雌雄各20只。非啮齿类常用狗，年龄为4~6月，每剂量组为雌雄各2只。对照组和试验组的动物数要相等。第45页,共126页，2024年2月25日，星期天

(2)剂量：常用三个剂量，大动物也可用两个剂量。在试验过程中，高剂量组应有部分动物出现毒性反应或死亡(≯20％)，低剂量组应当略高于药物对动物的有效量或临床试验用的剂量而不出现任何观察指标的异常。第46页,共126页，2024年2月25日，星期天

(3)给药途径：注射用药的给药途径应与推荐临床试验的给药途径相同，口服给药最好采用灌胃法。第47页,共126页，2024年2月25日，星期天

(4)试验周期：一般参考推荐临床试验的用药持续时间考虑，即动物试验连续给药期必须为临床试验给药期的3~4倍。例如，临床试验给药期为1~3d者，毒性试验给药期为2W。7d者，为4W。30d者，为3月。＞30d者，毒性试验给药期至少半年。

试验周期在半年以上的新药，可在长期毒性试验进行3个月后、未发现明显毒性反应的情况下，申请进行第Ⅰ期临床试验。第48页,共126页，2024年2月25日，星期天

(5)观察指标：一般体征、体重、外观、行为、尿常规、血常规、肝肾功能及重要器官的肉眼观察和病理检查，必要时作骨髓检查，血液生化，大动物应检查心率和心电图变化。凡有可能引起眼、耳毒性的药物，应增加眼、耳毒性检查指标。有些药物尚需研究对酸碱平衡、水盐代谢的影响。第49页,共126页，2024年2月25日，星期天产生毒性反应的新药至少应对高剂量组和对照组的动物在给药期结束后继续进行观察，对引起不可逆性功能损害和组织病变的药物，要慎重考虑临床试验问题。第50页,共126页，2024年2月25日，星期天对毒性较高、安全范围较小的特殊品种新药，如拟进行临床试验，最好通过研究找出一种解救药，以备过量中毒时使用。第51页,共126页，2024年2月25日，星期天有的新药还应根据其药理性质和用途，观察对注射部位(皮下、肌肉、血管)的刺激性，注射用生化制品应进行热原、异性蛋白及过敏试验。第52页,共126页，2024年2月25日，星期天

(二)局部用药毒性试验

局部用药(如呼吸道吸入以及粘膜、皮肤用药等)，大都可以被吸收。因此，局部用药应先进行局部吸收试验，根据药物从局部吸收的程度，考虑进行全身性用药的各项试验。根据用药方法，对用药部位要进行局部刺激性试验，用肉眼观察及组织切片的镜检，测试刺激性(即炎症)的发展和恢复情况。第53页,共126页，2024年2月25日，星期天

1．皮肤用药进行完整和破损皮肤的毒性试验以及皮肤致敏试验，除婴儿皮肤用药应使用刚成年动物外，其余均用成年动物。可选用家兔、豚鼠或大鼠。至少应设三个剂量组，每组动物数≮3只，以观察与剂量相关的毒性反应。观察期一般在停止敷用后不超过14d。第54页,共126页，2024年2月25日，星期天

2．滴鼻剂和吸入剂进行呼吸道(包括肺部)的局部刺激性和毒性试验。大鼠或豚鼠。每一个浓度组至少10只动物(雌雄各半)，至少设3个浓度组。接触吸入剂的时间不少于4h。观察期一般为14d。第55页,共126页，2024年2月25日，星期天

3．滴眼剂观察对眼结合膜和眼球的刺激作用。家兔为首选，至少用3只家兔。液体制剂的剂量一般每次用0.1ml，软膏等制剂每次≯100mg。观察期一般在停止给药后21d内，以观察出现反应的可逆性和不可逆性。第56页,共126页，2024年2月25日，星期天

4．局部作用于直肠、阴道的制剂，进行对作用部位的刺激及局部毒性试验。第57页,共126页，2024年2月25日，星期天

(三)特殊毒理研究

1．致突变试验根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点(基因突变和染色体畸变)的不同。要求新药必须做以下三项试验：第58页,共126页，2024年2月25日，星期天

(1)微生物回复突变试验

菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌四株(TA97、TA98、TA100、TA102)，亦可采用大肠杆菌(E.Coli)WP2若干株(大肠杆菌试验)。第59页,共126页，2024年2月25日，星期天

剂量选择：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。一般最大剂量可达5mg/皿。受试物至少应有5种不同的剂量，否则应说明选择剂量的理由。

代谢活化：应有诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体(S9)进行体外代谢活化试验，即在加S9混合物和不加S9混合物平行的条件下测试。

对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。第60页,共126页，2024年2月25日，星期天

结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。第61页,共126页，2024年2月25日，星期天

(2)哺乳动物培养细胞染色体畸变试验

细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。

剂量：至少应有三种不同剂量，高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选择剂量的理由。

标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间，最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后24和48h制作染色体标本。第62页,共126页，2024年2月25日，星期天

代谢活化：应用适当的代谢活化法。

对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。

镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。

结果判定：受试物诱发的染色体畸变出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频率和种类。第63页,共126页，2024年2月25日，星期天

(3)体内试验：一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。第64页,共126页，2024年2月25日，星期天

1)啮齿类动物微核试验

动物：一般用小鼠，每组10只性成熟动物(♀♂各半)或至少6只性成熟♂动物。

给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量以1/2LD50为基准，腹腔和/或口服一次给药，必要时可连续给药、否则应说明选定剂量的理由。

对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发微核阳性的物质作阳性对照。第65页,共126页，2024年2月25日，星期天

标本制作：给药后18~30h或12~72h处死动物，取骨髓，离心，涂片，Giemsa染色或吖啶橙染色。

镜检：每只动物至少观察计数1000个多染红细胞和正染红细胞的比率。

结果判定：微核细胞出现的频度与对照组相比有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时，或同一剂量有重复性并有统计学意义时记为阳性。第66页,共126页，2024年2月25日，星期天

2)啮齿类动物显性致死试验

动物：性成熟的啮齿类动物，一般采用小鼠。每组至少15只♂鼠。

给药剂量及途径：至少采用三种剂量，但在初期评价中单剂量或二种剂量即可。高剂量以30d连续给药使100％动物生存的最大耐受量为基准。口服或腹腔注射可采用一次给药，每天给药一次，连续给药5d或连续给药6W的方法之一。第67页,共126页，2024年2月25日，星期天

交配方法：给药的♂♂动物以适当的时间间隔依次与未给药的♀动物交配，交配时间取决于给药方式，一般一次或连续给药5d的动物，以最后给药后6W内为交配时间；连续给药6W的动物以最后给药后1W内为交配时间。第68页,共126页，2024年2月25日，星期天

对照组：用溶媒作阴性对照，已知能诱发显性致死阳性物质作阳性对照。但在同一实验室，对同一品系的动物，可不设阳性对照。

观察指标：交配的♀动物在妊娠后期剖腹，观察子宫内胚胎着床数，生存胎仔数，死亡胎仔数及未着床数。显性致死率以DL表示：

DL(100％)＝[1－(试验组妊娠鼠的平均生存胎仔数/阴性对照组妊娠鼠的平均生存胎仔数)]×100第69页,共126页，2024年2月25日，星期天

结果判定：死亡胎仔数的增加，胚胎着床总数的减少，或未着床胚胎数的增加，生存胎仔总数减少，这些结果有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性显性致死效应。

当上述三项致突变试验结果难以下结论时，可选择其他补充试验予以确证。第70页,共126页，2024年2月25日，星期天

2．生殖毒性试验所用药物至少应有2~3种剂量并设对照组。高剂量可产生轻度毒性反应，低剂量应为人临床拟用剂量的若干倍。给药途径原则上与推荐临床应用的给药途径相同，口服制剂应用灌胃法。第71页,共126页，2024年2月25日，星期天

(1)一般生殖毒性试验

动物：一种或一种以上试验动物，如用小鼠或大鼠每组♀♂各20只以上。

给药时期：选择性成熟的动物，交配前♂动物连续给药60d以上，♀动物连续给药14d。♀动物在确定已经交配后继续给药至多数胚胎器官发生期。第72页,共126页，2024年2月25日，星期天

检查：给药的♀动物与给药的♂动物同笼饲养期限最多2W。必要时给药动物可以和非给药动物分别交配。已交配的雌性动物，推定其妊娠末期及时解剖，观察妊娠的确立、胎儿的吸收和死亡及子宫内活胎的发育情况，并进行形态学检查(性别、外表及内部器官的形态学观察及骨骼透明标本的检查)，必要时进行组织学和组织化学的详细检查。给药的♂动物及未交配上的♀鼠均作剖检，必要时进行病理组织学检查。第73页,共126页，2024年2月25日，星期天

(2)致畸胎试验

动物：至少一种动物。一般采用小鼠或大鼠，每组15~20只孕鼠，家兔每组8~12只孕兔。

剂量：至少有2~3种剂量。并另设对照组，高剂量可有轻度毒性反应，低剂量应以拟议中的治疗量的某些倍量。

给药途径：与推荐临床应用的给药途径相同，口服制剂应用灌胃法。

给药时期：胚胎的器官形成期。第74页,共126页，2024年2月25日，星期天

检查：全部动物在妊娠末期剖检，观察妊娠的确立，有无死胎和吸收胎及子宫内活胎的发育情况，并进行形态学检查(性别、外表及内部器官的形态学观察及骨骼透明染色标本的检查)，必要时进行组织学和/或组织化学的详细检查。第75页,共126页，2024年2月25日，星期天某些新药需要观察其对子代的影响。动物数相应增加孕鼠10只，使其自然分娩，观察下一代直至成年。检查新生动物的存活、生长及发育情况，包括行为、生殖功能和其他异常症状。必要时还可对给药的♀动物长期观察其生殖、受孕、分娩及次子代的情况。第76页,共126页，2024年2月25日，星期天

结果处理：将数据汇总成表，尽量将全部观察的结果采用适当的统计学方法分析及评价。第77页,共126页，2024年2月25日，星期天

(3)围产期毒性试验

动物：小鼠或大鼠，每组15~20只孕鼠，家兔每组8~20只孕兔。

给药时期：妊娠后期及整个泌乳期。

检查：所有♀动物自然分娩，观察下一代直至成年，检查其新生后存活、生长和发育情况，其中包括行为、生殖功能及其他异常症状。必要时还可对给药的♀动物长期观察其生殖、受孕、分娩及次子代的情况。第78页,共126页，2024年2月25日，星期天

3．致癌试验在选择动物的种系时，应考虑其对感染疾患的抵抗性、寿命、自发肿瘤的频度系对致癌物的敏感性。同一药物的致癌性预备试验及致癌试验应该用同一饲养场饲养的同一种和系的动物。啮齿动物的给药时间，最好在断乳后尽早开始。第79页,共126页，2024年2月25日，星期天

(1)致癌试验的预备实验：应由急性毒性试验决定亚急性毒性试验的最高剂量，由亚急性毒性试验决定致癌试验的最高剂量，此剂量应具有：实验和对照组之比，体重增长抑制＜10％；无中毒死亡动物；一般形态变化不大。第80页,共126页，2024年2月25日，星期天啮齿类动物每组♀♂各10只，设三个试验组及一个对照组。给药途径应与进行致癌试验时准备采用的途径一致，连续给药90d。对有慢性蓄积性效应的药物，需延长给药期。药物混入饲料或饮水中给药的方式，要定期测定饲料或饮水的消耗量，以推算出药物的摄取量。第81页,共126页，2024年2月25日，星期天每天观察动物的一般情况，每周测量动物体重，对死亡动物及试验期末的动物均需作大体解剖，并作病理解剖记录。肉眼观察后，认为有病变或可疑病变的脏器进行病理组织学检查。第82页,共126页，2024年2月25日，星期天

(2)致癌试验

动物：试验组和对照组动物♀♂各50只以上。

剂量：至少应有三种以上剂量，一定要有溶媒或赋形剂对照组。

给药期：大鼠为24月以上，小鼠、地鼠为18月以上。第83页,共126页，2024年2月25日，星期天

观察指标：对所有动物每天应观察一般症状，开始时每周测一次体重和摄食量，第13W后，至少每4W测一次。应尽量减少肿瘤以外的死亡率。大鼠在试验24个月，小鼠、地鼠18个月时，各组的存活率不小于50％。试验期末解剖或怀疑有血液疾患时，最好做末梢血液白细胞及红细胞计数。第84页,共126页，2024年2月25日，星期天如果在试验组和对照组肉眼观察到有肿瘤性病变或可疑肿瘤病变时，则应对以下器官进行病理组织学检查：皮肤、乳腺、淋巴结、唾液腺、胸骨、脊椎及大腿骨(含有骨髓)、胸腺、气管、肺及支气管、心、甲状腺及副甲状腺、舌、食管、胃、十二指肠、大肠、小肠、肝、胰、脾、肾、肾上腺、睾丸、卵巢、性腺及其附属器官、眼球、脑下垂体、脊髓及其它。第85页,共126页，2024年2月25日，星期天如果试验组和对照组均无肉眼可见的肿瘤性病变，则对高剂量组的部分动物(1/2~1/3)的上述器官进行病理组织学检查，如发现有肿瘤病变则需对全部动物进行病理组织学检查。第86页,共126页，2024年2月25日，星期天

结果判断：符合下列情况之一者判断为阳性：①试验组肿瘤阳性，对照组阴性；②试验组和对照组均有肿瘤发生，但试验组肿瘤发生率高于对照组；③试验组肿瘤发生的部位多于对照组；④试验组和对照组肿瘤的发生率虽无明显差异，但试验组肿瘤出现早。第87页,共126页，2024年2月25日，星期天

(3)评价：如果在一种动物中发现有明确的致癌作用，预示对人可能有致癌潜力。如果在所有动物中(最好两种)都是阴性结果，则可判为阴性。第88页,共126页，2024年2月25日，星期天二、药品临床前毒性试验★

(一)目的

剔除毒性大的化学物，找出发生不良反应的靶器官和靶组织，以便在早期临床试验中注意观察这些器官和组织的构造及功能变化，最好还要找出这些不良反应与剂量和疗程间关系，毒性作用是可逆的，还是不可逆的，是可以预防的，还是不可避免的，如果能证实毒作用机制，就可以更精确地预测药品对人体毒性(但要考虑其不良反应是否与超剂量—反应的界限，就会出现与药理作用范围内的剂量缺乏联系的毒性反应)。第89页,共126页，2024年2月25日，星期天

(二)试验原则

●单次给药毒性试验

●重复给药毒性试验

●生殖、发育毒性试验

●致突变试验

●致癌试验

●皮肤过敏试验

●皮肤光敏性试验第90页,共126页，2024年2月25日，星期天

1.单次给药毒性试验

又称急性毒性，指一次给药。

目的:一次给予受试物后，从质与量两方面证明其毒性。第91页,共126页，2024年2月25日，星期天动物物种选用原则★

①解剖结构、生理生化、化学物

在体内的代谢与人类近似；

②经济可行；

③有符合试验要求的寿命长度；

④便于饲养管理。第92页,共126页，2024年2月25日，星期天常用毒理学试验的动物选择★

●一般毒性试验常选大鼠、小鼠；

●眼刺激试验常选家兔；

●皮肤刺激试验常选家兔、豚鼠；

●

致敏试验和光敏试验常选豚鼠；

●

生殖发育毒性试验常选大鼠；

●

致癌试验常选大鼠……

第93页,共126页，2024年2月25日，星期天

动物数量确定原则

即统计学中的样本含量问题，既要符合统计学要求，又不致人力、物力、财力、时间的浪费。第94页,共126页，2024年2月25日，星期天动物性别确定原则

至少一种，♀♂各半。某些特殊试验例外，如致癌试验可只用♂性动物。第95页,共126页，2024年2月25日，星期天

给药途径选择原则★

与人类实际接触途径一致。药物毒理学研究给药途径同临床。

但：临床po、iv，动物只iv。第96页,共126页，2024年2月25日，星期天单次给药毒性试验动物要求：两种以上，啮齿类动物(每组5只)，非啮齿类(2只)，要求二级以上动物(即饲养于简易屏障系统，无危害动物种群的微生物和寄生虫,为我国当前的合格的标准实验动物)。

性别：至少一种，♀♂各半。第97页,共126页，2024年2月25日，星期天

途径：临床po、iv，动物只iv。

剂量：设计的剂量组能全面掌握毒性剂量范围，要求能求出近似致死量足够的剂量范围，不一定LD50，非啮齿类要求能观察到出现明显毒性症状的剂量范围，并希望能显示出剂量—反应关系。(近似致死量：因用动物量少，剂距大，求出死亡率只能近似致死量，以xx～xxmg/kg范围表示)。

观察期：14d，死亡和存活动物均应剖检，异常者要做病理组织学检查。第98页,共126页，2024年2月25日，星期天常用LD50计算方法

●Horn(霍恩)氏法(又叫平均移动法、剂量递增法)

●寇氏法和改进寇氏法

●概率单位法

●序贯法(又叫平均数法、阶梯法、上－下法)

●Bliss法(又叫最大似然性法)第99页,共126页，2024年2月25日，星期天LD50计算方法之—Horn氏法简介

原理

Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂量对数与死亡率(反应率)的转换数(即几率单位)呈直线关系而设计的方法。

优缺点使用动物数少；可直接从Horn氏表查出LD50及其95％可信限，不需计算，甚为简便。但LD50的95％可信区间范围较大，方法精确度尚不够。第100页,共126页，2024年2月25日，星期天

Horn氏法设计原则★

4个剂量组；每组动物数相等；每组4只或5只；设计剂量时可根据化学物致死剂量范围的宽窄应用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16倍。根据每组动物数、组距和每组动物死亡数，即可从Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。

见《MicrosoftPowerPoint－霍恩法.ppt》第101页,共126页，2024年2月25日，星期天

2.重复给药毒性试验(包括亚急性和慢性毒性试验)

目的：观察剂量与反应的时间关系和首次出现的毒性变化及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况。

动物和性别：同单次给药毒性试验。

动物数：♀♂各半,每组≥10只(非啮齿类3只),如实验中要活杀,则要追加动物数。若毒性试验＞90d,♀♂各20只。

途径：同临床。

给药期：见表1，一般约为临床试验用药的3～9倍。第102页,共126页，2024年2月25日，星期天表1重复给药毒性试验给药期临床拟给药期动物试验给药期(月)单次或连续1W1＞1W或4W内连续给药3＞1月或6个月连续给药6＞6个月或蓄积性12第103页,共126页，2024年2月25日，星期天

剂量组别：至少3组(高剂量组有部分动物出现毒性反应或死亡≯20％)(毒性反应剂量、无毒性反应剂量、临床试用剂量)。对照组：溶媒对照,必要时设空白、阳性对照。观察指标：①一般状况：(体重、摄食量、饮水量)；②血、尿常规；③生理指标：如心、视、听等功能；④大体解剖、病理组织学检查。第104页,共126页，2024年2月25日，星期天

3.生殖、发育毒性试验将妊娠前到离乳期分为三个试验阶段：①妊娠前及妊娠初期；②胚胎器官形成期；③围产期及授乳期)。以掌握对生殖、发育的影响。要求三个阶段试验动物种系要统一，应选择受孕率高、自畸率低、对阳性物敏感的动物。第105页,共126页，2024年2月25日，星期天

⑴妊娠前及妊娠初期给药试验

动物：大鼠、小鼠任选一种(大鼠胎盘结构更接近人)，♀♂各20只。

给药途径：同临床。

剂量组别：3个剂量组、对照组(阳性、阴性、比较对照。后者指化学结构或药效与受试物相似的已知物质)。给药期：♂出生后40d连续给药60d以上，交配，直至交配成立止，♀成熟动物14d以连续给药后交配，怀孕直到胚胎的器官形成初期为止,大鼠(受孕0～7d)小鼠(0～6d)。试验方法：同致畸试验。观察身长、体重及头颅、肢体等有无畸形。第106页,共126页，2024年2月25日，星期天

⑵胚胎器官形成期给药试验

动物数：每组孕鼠30只以上。

给药期：大鼠受孕后7～17d，小鼠6～15d。⑶围产期及授乳期给药

动物数：大小鼠每组20只以上。

给药期：大鼠受孕后17～分娩后21d，小鼠受孕后15～分娩后21d，观察子代至成年的存活、生长和发育(展)情况。第107页,共126页，2024年2月25日，星期天

4.致突变试验：

原则上要进行：①细菌回复突变试验；②培养细胞的染色体畸变试验；③啮齿类动物的微核试验(体内试验)。

第108页,共126页，2024年2月25日，星期天

5.致癌试验

凡长期使用的新药或依其结构和药理作用怀疑致癌性应进行试验,但对用于罕见及难治疾病的药物,并且在临床使用,利大于弊时,可不受致癌性影响。

⑴试验动物：应考虑对疾病抵抗力、寿命、自发肿瘤发生率和已知对致癌性物质的敏感性等。

第109页,共126页，2024年2月25日，星期天

⑵试验方法：依据单次给药和重复给药结果决定剂量。高剂量要求与对照组比较10％以内体重增长受抑制，但不出现显著的毒性变化，没有中毒死亡，此结果可以通过预试验获得。

1)动物：2种以上，♀♂各半(多用大、小鼠)6W龄以下动物(最好同一周龄)。

2)动物数：♀♂各50只。

3)给药途径：同临床。第110页,共126页，2024年2月25日，星期天

4)剂量组：应设3组以上：

①高剂量组按上述要求设剂量，低剂量原则上应呈现药效或根据临床拟给药剂量决定，中间组是高、低剂量的等比中项。

②当与临床治疗比较毒性很低时，高剂量可按临床拟给药剂量的100倍设计。

③低剂量应是高剂量的10％以上，当其量显著偏离临床拟给药量时，可设计不足高剂量10％的剂量。

④混入饲料或饮水中给药(自然经口摄入)时，前三个月每周测一次摄入量和饮水量，以后每三个月测一次，以计算受试物摄入量。

第111页,共126页，2024年2月25日，星期天

5)对照组：阴性对照给受试物溶媒或乳化剂；空白对照。

6)给药期：大鼠24～30月,小鼠18～24月，连续给药，灌胃给药可给5d停2d。

7)试验期：大鼠最长30月,小鼠和仓鼠24月,当低剂量组或对照组动物累积死亡率达75％时,应全部剖杀。实验期间要求各组存活率≮50％。

8)试验方法：称体重前3月1次/W，以后每月1次，死亡动物及时剖检(病理)，实验结束应剖检高剂量组，发现靶器官以便有目的检查。

第112页,共126页，2024年2月25日，星期天

9)结果判断

①试验组肿瘤阳性,对照组阴性(有与无)；

②两组均有肿瘤,试验组>对照组(P<0.05)(多与少)；

③试验组肿瘤发生部位多于对照组(部位多少)；

④两组肿瘤发生率无差异,试验组出现早(早与晚)。第113页,共126页，2024年2月25日，星期天

6．皮肤过敏试验(针对外用药物)

1)剂型：液体、半固体可直接用，固体应用水或溶媒湿润后用。

2)动物：豚鼠，每组5只。

试验组：①受试物涂敷组；②阳性对照(1-氯-2,4-二硝基苯)；③阴性对照(空白、基质、乳化剂)。

第114页,共126页，2024年2月25日，星期天

试验步骤

①背部皮肤脱毛(2×4cm)；

②将蒸馏水、受试剂、溶剂0.1ml±对称皮内注射；

③1W后在皮肤注射部位涂敷月桂醇硫酸钠(1％凡士林),次日在同一部位帖敷封包0.2ml/0.2mg(液/固)受试物;

④激发致敏结束2W后，同一部位帖敷受试物24h；

⑤评价：去帖敷后24、48h观察皮肤反应,以红斑、水肿程度、频率与阳性对照、阴性对照比较。

第115页,共126页，2024年2月25日，星期天

7．皮肤光敏性试验

方法同皮肤过敏试验，只是在致敏后3W，于豚鼠背部一侧以锡纸遮光，以10Joales/cm2的紫外线照射。

第116页,共126页，2024年2月25日，星期天

三、药效试验研究的基本要求

1.掌握药物的化学结构和理化特性。

2.以整体动物体内试验为主，试验动物应符合国家规定的等级动物要求(二级，即清洁级动物：饲养于简易屏障或隔离系统，应排除对动物有危害的微生物和寄生虫，即按我国国情采用的过渡级别。发达国家用三级，即无特定病原体动物)，必要时配合体外试验，从不同层次证实其药效，充分证实其主要治疗作用以及较重要的其他治疗作用。动物模型应符合治疗病征。

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3.观测指标：应选用特异性强、敏感性高、重现性好、客观、定量或半定量的指标进行观测，对实验方法应作详细叙述。

4.给药量及途径

剂量：应设两个组,其中一个剂量相当于临床剂量的2～5倍(小鼠10～15倍)，大动物可仅设一个剂量，药效试验量不应高于长期毒性试验剂量。

途径：二种，一种与临床相同。

第118页,共126页，2024年2月25日，星期天

5.对照药：

空白对照：正常及模型动物对照组，必要