药物分析第十一章抗生素类药物的分析

药物分析第十一章抗生素类药物的分析一、概述1.抗生素（antibiotics）：

在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称2.分类β–内酰胺类氨基糖苷类四环素类大环内酯类多烯大环类多肽类第2页,共33页，2024年2月25日，星期天3.来源：生物合成（发酵）化学合成或半合成4.抗生素的特点：

化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差生产工艺复杂发酵过程不易控制易受污染第3页,共33页，2024年2月25日，星期天5.抗生素质量分析采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：

微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高；但操作复杂费时

理化方法：准确度与专属性较高,且操作简便；但与临床疗效有偏差第4页,共33页，2024年2月25日，星期天二、β–内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类1.化学结构：青霉素类：6-APA为母核头孢菌素类：7-ACA为母核*****第5页,共33页，2024年2月25日，星期天2.主要理化性质：1）酸性（羧基）：

pKa2.5-2.8酸性较强与碱金属成盐后水溶性好2）UV（共轭）：

青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构第6页,共33页，2024年2月25日，星期天3）旋光性：

有多个手性碳4）稳定性（内酰胺）：

干燥条件较稳定，溶液不稳定

青霉素

降解、失效氧化剂、酸、碱酶、金属离子、Δ第7页,共33页，2024年2月25日，星期天3.鉴别1）羟肟酸铁反应：β–内酰胺类

羟肟酸

显色2）茚三酮反应α-氨基

蓝紫色3）双缩脲反应β–内酰胺类紫色4）光谱法（UV、NMR）5）色谱法（HPLC、TLC）NH2OH·HClNaOHFe3+H+茚三酮Δ

碱性酒石酸铜呈色反应第8页,共33页，2024年2月25日，星期天头孢利定的NMR鉴别法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示δ3.8附近δ6.9～7.5δ7.9～9.0

单峰信号多重峰信号多重峰信号

2：3：5强度比第9页,共33页，2024年2月25日，星期天头孢氨苄鉴别的TLC条件ChP(2000)5mg/ml2µl

硅胶G

0.1mol/L枸橼酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液显色USP(24)25mg/ml5µl

硅胶

醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波长UV光检出BP(1999)0.4%(W/V)1µl

硅烷化硅胶HF25415.4%NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm检出第10页,共33页，2024年2月25日，星期天4.特殊杂质检查聚合物、有关物质、异构体等头孢他啶中聚合物测定色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40～120

m）为填充剂，玻璃柱内径1.3～1.5cm，床体积50～60ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200

l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200

l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%第11页,共33页，2024年2月25日，星期天对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100

g的溶液，摇匀测定法取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200

l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200

l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%第12页,共33页，2024年2月25日，星期天头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

色谱条件与系统适用性试验：测定头孢呋辛酯的HPLC系统为ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:׃38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500第13页,共33页，2024年2月25日，星期天异构体

取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的甲醇-流动相(1

1)的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。

40020600302010时间(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401第14页,共33页，2024年2月25日，星期天

有关物质

取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成每1ml中约含6

g的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20

l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20

l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积第15页,共33页，2024年2月25日，星期天5.含量测定1）碘量法（ChP2000）原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其碱性降解产物可消耗碘青霉素族头孢菌素族NaOH水解4I2H+8I-I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6定量过量剩余第16页,共33页，2024年2月25日，星期天反应分两步进行：水解反应(按化学计算量进行)氧化-还原反应(无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定)第17页,共33页，2024年2月25日，星期天空白试验因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验空白试验与经典空白试验不同：加入样品，不加碱，其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加第18页,共33页，2024年2月25日，星期天试验条件：（I2氧化）弱酸性（pH4.5）碱↑I2→IO3-+I-

酸↑某些药物与碘生成复盐沉淀温度（24～26℃）温度＞38℃时未水解的供试品亦消耗碘反应时间：（20分钟）20分钟后，耗碘量随时间的变化较小第19页,共33页，2024年2月25日，星期天特点灵敏度高：样品:碘=1:8反应条件、实验操作要求高含量1份含量V对、V对空V样、V样空加试剂次序、反应时间、滴定速度相同含量％＝×

×

对照品％

V样空-V样W对V对空-

V对W样第20页,共33页，2024年2月25日，星期天2）电位配位滴定法（汞量法）

原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和

Hg++2R-SH(RS)2Hg+2H+

方法说明：

a空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOHb与碘量法相比，汞量法不需对照试验第21页,共33页，2024年2月25日，星期天3）酸碱滴定法4）硫醇汞盐法

青霉素青霉烯酸硫醇汞盐5）羟肟酸比色法

β–内酰胺类红色6）HPLC法：应用广泛咪唑HgCl2（λmax324～345nm）NH2OHH+Fe3+第22页,共33页，2024年2月25日，星期天阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5

测定法取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10

l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第23页,共33页，2024年2月25日，星期天三、氨基糖苷类1.化学结构链霉素

都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷分子结构中都含有多羟基均为碱性抗生素第24页,共33页，2024年2月25日，星期天2.性质1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解第25页,共33页，2024年2月25日，星期天3.鉴别1）茚三酮反应：具羟基胺类,α-氨基酸性质

链霉素+

水和茚三酮蓝紫色2）N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：链霉素N-甲基葡萄糖胺

红色水解对二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH-第26页,共33页，2024年2月25日，星期天3）麦芽酚（Maltol)反应(链霉糖特有）链霉素麦芽酚紫红色OH-重排Fe3+8-羟基喹啉NaOBr或α-萘酚

OH-水解4）坂口（Sakaguchi）反应：(链霉胍特有）

链霉素链霉胍橙红5）硫酸盐反应第27页,共33页，2024年2月25日，星期天4.检查1）链霉素中链霉素B的检查

来源：发酵中产生

BP：薄层色谱法（杂质对照品法）第28页,共33页，2024年2月25日，星期天2）庆大霉素C组分测定（系统适用性试验）色谱柱：ODS

流动相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2M)，必要时调节甲醇的含量检测波长：330nm（邻苯