荧光磷光分析

荧光磷光分析§2.1分子发光的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。第2页,共56页，2024年2月25日，星期天荧光是如何产生的？

激发态光辐射基态分子荧光磷光非辐射跃迁第3页,共56页，2024年2月25日，星期天一.分子荧光与磷光的产生1.单重态与三重态2.分子的活化与去活化3.分子发光的类型按激发的模式分类：按分子激发态的类型分类：光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光

分子发光分子发光荧光磷光瞬时荧光：分析中有意义迟滞荧光：刚性、粘稠介质中

按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：（溶液中）λex<λem反斯托克斯荧光(Antistokes)：（高温稀薄气体中）λex>λem共振荧光(Resonance)：（气体、晶体中）λex=λem荧光

第4页,共56页，2024年2月25日，星期天电子自旋状态的多重性大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的

，处于基态单重态。用“S0”表示；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋=0.这种跃迁是符合光谱选律的

基态单重态S0第一激发单重态S1S0,S1,S2,S3分别代表基态,第一,二,三激发单重态单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8第5页,共56页，2024年2月25日，星期天若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋

0。这种跃迁为禁阻跃迁

T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态基态单重态S0第一激发三重态T1自旋平行三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4~1S第6页,共56页，2024年2月25日，星期天分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃:

S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~

S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec第7页,共56页，2024年2月25日，星期天荧光及磷光的产生分子具有一系列严格分立的能级—电子能级每个电子能级中又含有一系列振动能层和转动能层分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图电子能级转动能级振动能级第8页,共56页，2024年2月25日，星期天单重态：如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的，即s=0,分子的多重度=1,该分子体系处于单重态基态(S0):室温下，分子处于基态的振动能级。此时所有电子皆遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特规则。激发态:被激发后,能量变高,属非稳状态。单重态（S）三重态（T）基态S0第一电子激发态S1第二电子激发态S2三重态T1T2三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子具有两个自旋不配对的电子洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定。Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。第9页,共56页，2024年2月25日，星期天去活过程：从激发单重态（S1、S2）或激发三重态（T1）回到基态（S0）非辐射过程＋发射光子的过程

分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为分子发光。

荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的光，当紫外光停止照射时,随之消失的光叫做荧光，不立即消失的光叫磷光。第10页,共56页，2024年2月25日，星期天VRVRVRv=0v=0v=01v=023121212S2S1S0T1分子内的光物理过程VR-振动驰豫，是指在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。VR-振动驰豫第11页,共56页，2024年2月25日，星期天振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）

在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从Sn高振动能层失活至该电子能级最低振动能层的过程，称为振动弛豫。

高振动能级→低振动能级发生振动弛豫的时间：10-12s第12页,共56页，2024年2月25日，星期天icicv=0v=0v=01v=023121212S2S1S0T1

分子内的光物理过程ic-内转化，是相同多重态的两个相邻电子态之间的非辐射跃迁。ic-内转化第13页,共56页，2024年2月25日，星期天内转换（InternalConversion，IC）

当两个电子能级非常靠近,以致其振动能级有重叠时，发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁【例】:高电子能能级→→低电子能级S2→→

S1T2→→T1发生内转换的时间：10-13

～10-11s第14页,共56页，2024年2月25日，星期天iscv=0v=0v=01v=023121212iscS2S1S0T1

分子内的光物理过程isc-体系间窜跃，是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。isc-体系间窜跃第15页,共56页，2024年2月25日，星期天体系间窜跃（IntersystemConversion，ISC）两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间跨跃。

不同多重态的两个电子能态间的非辐射跃迁外转换（ExternalConversion，EC）受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换,而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”第16页,共56页，2024年2月25日，星期天v=0v=0v=01v=023121212FPS2S1S0T1

分子内的光物理过程分子荧光，处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时产生的辐射跃迁。分子荧光第17页,共56页，2024年2月25日，星期天荧光发射荧光：分子中电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光。荧光发射：产生荧光的过程S1→→S0第18页,共56页，2024年2月25日，星期天v=0v=0v=01v=023121212FPS2S1S0T1分子内的光物理过程分子，处于亚稳态的电子激发三重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时产生的辐射跃迁。磷光第19页,共56页，2024年2月25日，星期天磷光发射

从单重态（S）到三重态（T）分子间发生系间跨越跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。第20页,共56页，2024年2月25日，星期天S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子内的光物理过程第21页,共56页，2024年2月25日，星期天去活化过程（Deactivation）过程：激发态分子→辐射或非辐射跃迁等→基态处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式等再回到基态。去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫内转换外转换系间跨越第22页,共56页，2024年2月25日，星期天

分子被激发时的散射问题

激发光的能量太低、不足以外层电子跃迁到S1

但仍可将电子激发至基态的高振动能级上受激后能量无损失，瞬间(10ˉ¹²s)返回原能级受激发后有能量改变,返回原来稍高或稍低能级上在不同方向上发射与原激发光相同波长λ1的辐射瑞利散射不同方向伴随的波长发射为λ1±Δλ拉曼散射散射光波长＝激发光波长拉曼带波长随激发光波长而变

举例：在0.1mol/L硫酸中，硫酸奎宁荧光光谱的变化第23页,共56页，2024年2月25日，星期天二.分子荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。A.激发光谱固定

em=620nm(MAX)

ex=290nm(MAX)固定发射波长扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似第24页,共56页，2024年2月25日，星期天

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)B.发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长C.激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S14321发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1第25页,共56页，2024年2月25日，星期天D.磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱第26页,共56页，2024年2月25日，星期天2.三维荧光光谱IF

∝f(λex

、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长第27页,共56页，2024年2月25日，星期天IF

∝f(λex

、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长第28页,共56页，2024年2月25日，星期天蒽的三维等高线光谱图第29页,共56页，2024年2月25日，星期天蒽的三维等荧光强度光谱第30页,共56页，2024年2月25日，星期天VB1和VB2的三维荧光光谱第31页,共56页，2024年2月25日，星期天三.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：第32页,共56页，2024年2月25日，星期天对于稀溶液，当

bc<0.05（磷光

bc<0.01）时：IF----荧光强度

F-----荧光量子产率k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度。IP----磷光强度

P-----磷光量子产率b--吸收光程

--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度2.讨论¤I0变化对荧光强度的影响¤比UV-Vis的灵敏度高得多（2-4个数量级）为什么？第33页,共56页，2024年2月25日，星期天3.荧光(磷光)的量子产率荧光量子产率的定义：kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；

st系间窜跃效率。

ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，

F=0.55；

荧光素

F=1化合物

F0.110.290.460.600.52第34页,共56页，2024年2月25日，星期天1.跃迁的类型二.荧光与有机化合物的结构对于有机荧光物质:π*

→π

n→π*εmax＜

100平均寿命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均寿命10-7~10-9seckS→T小π*→nπ*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备下特征:①具有大的共轭π键结构；②具有刚性的平面结构；③具有最低的单重电子激发态为S1为π*

→π型；④取代基团为给电子取代基。§2.2分子荧光与磷光强度的影响因素一.荧光的量子产率第35页,共56页，2024年2月25日，星期天2.共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640

F0.110.290.460.600.52荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构芴联苯

F=1

F=0.2第36页,共56页，2024年2月25日，星期天不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光

F=0.92萘VA

F(萘)=5

F(VA)

荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯第37页,共56页，2024年2月25日，星期天1）给电子取代剂加强荧光4.取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）得电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光第38页,共56页，2024年2月25日，星期天空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质

F=0.75

F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质电离效应对荧光发射的影响OH-H+OH-H+pH=1,有荧光pH=13,无荧光无荧光有荧光第39页,共56页，2024年2月25日，星期天含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。5.重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488

P/

F0.0930.0530.0685.26.4>1000τ

p(s)2.62.51.40.230.0140.00236.溶剂效应蓝移:△

En→π*

＜△

En→π*红移:△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*在极性溶剂中：无溶剂化作用有溶剂化作用第40页,共56页，2024年2月25日，星期天三.金属螯合物的荧光1.螯合物中配位体的发光2.螯合物中金属离子的发光8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光2,2`-二羟基偶氮苯无荧光2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光T1系间窜跃S0S1d*、f*

d*→

df*→

f荧光分子内能量转移第41页,共56页，2024年2月25日，星期天四.荧光的熄灭1.碰撞熄灭荧光熄灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。相对速率

1K1[M*]K2[M*][Q]与分子的直径、粘度、温度等因素有关。2.能量转移熄灭再吸收过程：共振能量转移：分子内能量转移：hv激发发射熄灭第42页,共56页，2024年2月25日，星期天3.氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4.自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：没有除氧，溶液中难以观察到磷光由于

F<1，使荧光强度减弱或消失.形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。第43页,共56页，2024年2月25日，星期天§2.3荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？第44页,共56页，2024年2月25日，星期天第45页,共56页，2024年2月25日，星期天二.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大第46页,共56页，2024年2月25日，星期天3.高压汞灯光源应用广泛的线光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射单色器光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射滤光片第47页,共56页，2024年2月25日，星期天玻璃滤光片的透射率干涉滤光片的透射率截止涉滤光片的透射率第48页,共56页，2024年2月25日，星期天三.单色器平面衍射光栅线色散率聚光本领分辨率四.检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109五.样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题闪跃特性第49页,共56页，2024年2月25日，星期天六.磷光分光光度计1.光学系统与荧光分光光度计的区别光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器切光器（斩波器）共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光：100~10-4sec2.样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。第50页,共56页，2024年2月25日，星期天§12.４荧光分析法的应用一.工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104.荧光熄灭工作曲线法FxFCsCx直接荧光标准曲线法FCsFxCx二.荧光分析法的灵敏度第51页,共56页，2024年2月25日，星期天在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。三.荧光分析的应用1.无机化合物直接荧光测定法其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、