DNA的生物合成复制市公开课一等奖省赛课微课金奖课件

核酸生物合成DNA生物合成RNA生物合成1/75当代生物学已充分证实，核酸是生物遗传物质基础。除少数RNA病毒外，几乎全部生物均以DNA为遗传信息载体。2/751958年，Crick提出了遗传信息“中心法则”。DNA经过复制（replication）将遗传信息由亲代传递给子代；经过转录（transcription）和翻译（translation），合成特异蛋白质，以执行各种生命功效，使后代表现出与亲代相同遗传性状。DNA复制、转录和翻译过程就组成了分子生物学中心法则（centraldogma）。补充：在一些情况下，RNA也能够是遗传信息基本携带者。如：RNA病毒能以本身RNA分子为模板进行复制；致癌RNA病毒还能经过逆转录方式将遗传信息传递给DNA。DNA复制转录翻译RNA逆转录蛋白质复制（病毒）3/75第一节DNA生物合成DNA自我复制逆转录作用DNA损伤、修复和突变4/75一、DNA自我复制（一）半保留复制（semiconservativereplication）双螺旋DNA每一条DNA链作为模板复制一条新链，可产生两个新双螺旋DNA分子，这两个子代DNA分子都含有一条新链、一条旧链。与之相对是全保留复制：由复制产生新合成DNA链组成双螺旋分子，而亲本双链得以保留。动画：DNA

replication5/751958年Meselson

和Stahl用同位素示踪和密度梯度离心方法证实了DNA半保留复制。该试验首先将大肠杆菌在含15N培养基中培养约15代，使其DNA中碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N培养基中同时培养一代、二代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将含有不一样密度DNA分离开。DNA半保留复制试验证实动画：DNA半保留复制试验6/75按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA碱基序列一致，即子代保留了亲代全部遗传信息，表达了遗传保守性。半保留复制意义7/75模板

底物解螺旋酶

单链结合蛋白拓扑异构酶

引物、引物酶DNA聚合酶

DNA连接酶（二）DNA复制条件8/75DNA复制是模板依赖性，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

1.模板（template）9/75以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。2.底物（substrate）dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱氧核苷三磷酸。10/75解螺旋酶（helicase），又称解链酶，是用于解开DNA双链酶蛋白。大肠杆菌有4中解螺旋酶，即解螺旋酶I、II、III和Rep蛋白，其中Rep蛋白是最主要解螺旋酶。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP，依靠水解ATP提供解链所需要能量。3.解螺旋酶11/75单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB），是一些能够与单链DNA结合蛋白质因子。4.单链DNA结合蛋白使解开双螺旋后DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，防止核酸酶降解。12/7513/755.DNA拓扑异构酶引发拓扑异构反应酶称为拓扑异构酶（topoisomerase）。DNA复制时模板DNA超螺旋松弛和复制后超螺旋再恢复都需要拓扑异构酶参加。解链过程中正超螺旋形成拓扑一词含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变性质。

DNA分子中存在打结，缠绕、连环现象。14/75拓扑异构酶I切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当初候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶II切断DNA分子两股链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。按照作用机制，拓扑异构酶可分为I、II两种类型。动画：拓扑异构酶15/75拓扑异构酶II也叫旋转酶（gyrase），在有ATP功效情况下，可引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生扭曲张力，它和拓扑异构酶I一起共同控制着DNA拓扑结构。16/75引物酶（primase）本质上是一个依赖DNARNA聚合酶，该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物（primer），以提供自由3’-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物合成。6.引物、引物酶在E.coli中，含有DnaB蛋白、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA复制起始区域复合结构被称为引发体（primosome）。17/75许多与DNA复制直接相关基因被称为dna基因；不过也有其它不一样名称。与复制相关基因：dnaA、dnaB、…dnaX对应基因产物：DnaA、DnaB…DnaXDnaA：识别复制起始点oriC（originC）；DnaB：引发体组分，含有解螺旋酶活性；DnaC：引发体组分，帮助DnaB结合于起点；DnaG：引物酶，合成前体片段引物。18/75引物酶催化合成短链RNA引物分子

RNA引物大小，在原核生物中通常为50~100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物碱基次序，与其模板DNA碱基次序相配对。19/757.DNA聚合酶全称：依赖DNADNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase，DDDP），简称：DNA-pol活性：1.5

3

聚合酶活性；2.核酸外切酶活性DNA聚合酶催化DNA链延长20/75

核酸酶：作用于核酸磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作用位置分为:1.核酸外切酶：作用于核酸链末端（3’端或5’端），逐一水解下核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶：只作用于DNA；核糖核酸外切酶：只作用于RNA。

2.核酸内切酶：从核酸分子内部切断3’，5’-磷酸二酯键。限制性内切酶：在细菌细胞内存在一类能识别并水解外源双链DNA核酸内切酶，可用于特异切割DNA，常作为工具酶。21/75在原核生物中，主要DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶I（polI），DNA聚合酶II（polII），DNA聚合酶III（polIII），这三种酶都属于含有各种酶活性多功效酶。1999年发觉DNA聚合酶

IV、V。参加DNA复制主要是polIII和polI。（1）种类和生理功效22/75DNA聚合酶I：主要功效是参加DNA修复，切除RNA引物并填补其留下空隙缺口。DNA聚合酶II：主要功效可能是参加DNA损伤修复。（详细不祥）DNA聚合酶III：是催化大肠杆菌DNA复制主要酶。23/75

原核生物中三种DNA聚合酶

24/75真核生物DNA聚合酶25/75为了确保遗传稳定，DNA复制必须含有高保真性。DNA复制时保真性主要与以下原因相关：

1．恪守严格碱基配对规律；

2．DNA聚合酶在复制时对碱基正确选择；

3．对复制过程中出现错误及时进行校正。（2）DNA复制保真性（fidelity）26/75DNA-polI核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-polI外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配正确底物。B：碱基配对正确，DNA-polI不表现外切酶活性。27/75DNA连接酶（DNAligase）可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键形成，从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链。8.DNA连接酶DNA连接酶连接作用DNA连接酶催化条件是：①需一段DNA片段含有3’-OH，而另一段DNA片段含有5’-Pi基；②未封闭切口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。28/75DNA连接酶在复制中起最终接合切口作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。是基因工程主要工具酶之一。DNA连接酶作用29/75（三）原核细胞DNA复制过程复制起始

链延长

链终止

以大肠杆菌染色体（闭环DNA分子）复制为例。30/75DNA在复制时，需在特定位点起始，这是一些含有特定核苷酸排列次序片段，即复制起始点（origin）。在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点碱基序列是高度保守。关键序列是两组短重复：3个13bp重复序列和4个9bp重复序列。1.复制起始点和方向大肠杆菌复制原点OriC中特殊序列31/75DNA复制时，以复制起始点（origin）为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为双向复制（bidirectionalreplication）。但在低等生物中，也可进行单向复制。双向复制32/75E.coli染色体DNAθ复制：复制时有一个复制起点，双向展开，形成θ状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称θ复制。33/75真核细胞基因线状DNA上含有多个复制起点，是多复制子。真核细胞DNA链较原核生物长很多，聚合速度又较慢，怎样处理？34/75习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间距离（或DNA片段）定为一个复制子（replicon）。复制子是独立完成复制功效单位。DNA复制时，在复制起始点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状，这种叉状结构称为复制叉（replicationfork）。35/75复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）36/75大约20个各带1个ATPDnaA蛋白结合到9bp重复序列上，DNA缠绕在上面，形成起始复合物（initialcomplex）。HU复合物是类组蛋白，可与DNA结合，促进起始，受其影响，邻近3个13bp重复序列被变性成开放复合物，即解链而形成一小段单链，所需能量由ATP供给。DnaB在DnaC帮助下结合于解链区，DnaB借助水解ATP产生能量，沿DNA链5’→3’方向移动，解开DNA双链。再与引物酶（DnaG蛋白）组装成引发体（primosome），以备引物和DNA合成。起始过程37/75DnaB（解旋酶）、DnaA和DnaC参加解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶组成引发体（primosome），并合成RNA引物，以DNA为模板，合成一段短RNA片段，从而取得3'端自由羟基（3'-OH）。解链造成超螺旋，由拓扑异构酶II实现超螺旋转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。38/7539/752.复制延长

复制延长指在DNA聚合酶催化下，以3’→5’方向亲代DNA链为模板，从5’→3’方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，磷酸二酯键不停生成。在原核生物中，参加DNA复制延长是DNA聚合酶III。40/75

复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制。当复制叉沿DNA模板向前移动时，新生成DNA方向与复制叉移动方向相同吗？半不连续复制41/75DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链方向必须是3'→5'。因为DNA分子中两条链走向相反，所以当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链聚合方向也是不一样。半不连续复制42/75在DNA复制时，以3’→5’方向亲代DNA链作模板子代链在复制时是连续进行，其子代链聚合方向为5’→3’，延伸方向与复制叉移动方向相同，这一条链被称为前导链（leadingstrand）。以5’→3’方向亲代DNA链为模板子代链在复制时则是不连续，由许多5’→3’DNA片断组成，延伸方向与复制叉移动方向相反，这条链被称为滞后链（laggingstrand）。滞后链上每一段DNA短链称为称为冈崎片段（Okazakifragment）。冈崎片段大小，在原核生物中约为1000～个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制半不连续性。

43/75前导链先由引物酶在起点处合成一段RNA引物，随即DNApolIII即在引物上加脱氧核苷酸。前导链合成与复制叉移动同时。44/75滞后链合成是分段进行，需要不停合成冈崎片段RNA引物，然后由DNApolIII加入脱氧核苷酸。引发体主要在DNA滞后链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不一样部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA3’-OH末端接下去合成DNA片段，这就是滞后链不连续合成开始。45/75因为DNA两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个DNApolIII不对称二聚体合成，滞后链必须绕成一个环状（loop）。

DNA聚合酶III全酶是一个含有双活性位点非对称聚集体，催化前导链和滞后链同时复制46/75

（1）去除引物，填补缺口（gap）：在复制过程中形成RNA引物，需由DNA聚合酶I（5’→3’外切酶活性）来水解去除；RNA引物水解后遗留缺口，由DNA聚合酶I（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延长缺口处DNA，直到剩下最终一个磷酸酯键缺口。（2）连接冈崎片段：在DNA连接酶催化下，生成最终一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整DNA长链。47/75大肠杆菌环状DNA，在oriC区染色体是双向复制，形成两个背道而驰复制叉，当两个复制叉碰在一起时，复制终止。两个复制叉最终相遇在有多重拷贝Ter序列终止区域。Ter序列长20bp，是终点利用蛋白（即Tus蛋白）结合位点。Tus蛋白结合在终止位点有利于阻挡移动复制叉。Tus-Ter复合物，能够停顿先期抵达复制叉推进，等候后期抵达复制叉，使二者总能相遇，完成复制。3.复制终止

48/75DNA复制过程动画：DNA复制49/75复制起始（1）复制原点：OriC序列，富含AT（2）DNA解链酶解开双链DNA（3）

SSB结合于DNA单链（4）DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来扭曲张力（5）DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物复制延伸：（6）DNA聚合酶Ⅲ在两条新生链上同时合成DNA（7）DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物，并补上DNA（8）DNAligase连接一个冈崎片段复制终止：（9）形成Tus-Ter复合物DNA复制过程小结50/75（四）真核细胞DNA复制（自学）51/751970年有些人从致癌RNA病毒中发觉了依赖于RNADNA聚合酶（RNA-dependentDNApolymerase）或称RNA指导DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），即逆转录酶（reversetranscriptase，RT），能以RNA为模板合成DNA。这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA过程相反，故称为逆转录（ReverseTranscription）。反转录酶发觉使中心法则更完善。二、逆转录作用DNA转录RNA逆转录复制（病毒）52/75（一）逆转录酶以病毒RNA为模板合成cDNA逆转录病毒细胞内逆转录现象：逆转录酶含有:依赖于RNADNA聚合酶活性核糖核酸酶H

活性（降解RNA活性）依赖于DNADNA聚合酶活性逆转录酶作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，合成一条与RNA模板互补DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA（complementaryDNA，cDNA），它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体；随即又在逆转录酶作用下，水解掉RNA链；再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导DNA合成过程。53/75携带逆转录酶病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠逆转录酶催化合成DNA，随即这种DNA环化并整合（integration）到宿主细胞染色体DNA中去，以前（原）病毒（provirus）形式在宿主细胞中一代代传递下去。54/75

逆转录病毒生活周期动画：逆转录55/75（二）逆转录病毒引发癌症或艾滋病许多逆转录病毒进入细胞后，经过逆转录整合到宿主染色体上并随之同时复制。一些逆转录病毒上带有致癌基因（oncogene），可引发宿主细胞分裂失控和生长异常，形成肿瘤或癌症。56/75取得性免疫缺点综合症（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS），是由人类免疫缺点病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染而引发以T淋巴细胞免疫功效缺点为主一个免疫缺点病。HIV病毒是一个逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体免疫细胞，使人体产生免疫缺点。治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究主要靶酶。核苷类似物：竞争性抑制HIV-1逆转录酶活性，并在逆转录中终止cDNA链延伸，如3’-叠氮脱氧胸苷（AZT），在逆转录酶合成病毒DNA时，ATZ掺入到病毒DNA中，因为AZT无3’-OH，所以使病毒DNA合成终止。57/75逆转录研究意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中重大发觉。

逆转录现象说明：最少在一些生物，RNA一样兼有遗传信息传代与表示功效。对逆转录病毒研究，拓宽了20世纪初已注意到病毒致癌理论。

58/75三、DNA损伤、修复和突变DNA受到自然原因或诱变原因作用，结构会出现不一样程度损伤或产生突变；生物体中存在有特殊修复系统，能够对一些损伤进行适当修复。59/75

（1）自发原因：自发脱碱基：因为N-糖苷键自发断裂，引发嘌呤或嘧啶碱基脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。复制错配：因为复制时碱基配对错误引发损伤，发生频率较低。引发DNA损伤原因（一）DNA损伤60/75（2）物理原因：由紫外线、电离辐射、X射线等引发DNA损伤。其中，X射线和电离辐射经常引发DNA链断裂，而紫外线经常引发嘧啶二聚体形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体因为形成了共价键连接环丁烷结构，因而会引发复制障碍。UV胸腺嘧啶二聚体形成61/75（3）化学原因：

脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。62/75烷基化剂：这是一类带有活性烷基化合物，可提供甲基或其它烷基，引发碱基或磷酸基烷基化，甚至可引发邻近碱基交联。DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引发损伤。碱基类似物：如5-FU等可掺入到DNA分子中引发损伤或突变。断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引发DNA链断裂。63/75（二）DNA修复系统

是对已发生分子改变赔偿办法，使其尽可能回复为原有天然状态。

光复活（photoreactivation）切除修复（excisionrepair）重组修复（recombinationrepair）

SOS修复（SOSrepair）修复主要类型：64/75能够修复因为UV照射而形成嘧啶二聚体。修复过程由光裂合酶（photolyase）催化完成。（1）光复活（photoreactivation）其修复过程为：光裂合酶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在400～500nm可见光照射下，酶取得能量，将嘧啶二聚体丁酰环打开。光裂合酶从DNA上解离。65/75这是一个广泛存在修复机制，可适合用于各种DNA损伤修复。切除修复机制基本过程是将受损DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。（2）切除修复（excisionrepair）66/75在原核生物中，与DNA切除修复相关蛋白质包含UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApolⅠ和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起识别和结合受损部位作用；而UvrC则主要与受损片段切除相关。原核生物DNA切除修复机制67/75又称为复制后修复。修复时，利用重组蛋白RecA核酸酶活性，将另一股完整亲链与损伤缺口相互交换。在E.coli中参加重组修复酶：RecA、RecB、RecC、DNApolI和连接酶。

（3）重组修复（recombinationrepair）68/75

（4）SOS修复（SOSRepair）SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导一个DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组完整性，提升细胞生成率，但留下错误较多，故又称为错误倾向修复（errorpronerepair），使细胞有较高突变率。属于紧急修复。当DNA两条链损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶作用下造成损伤处DNA链空缺，再由损伤诱导产生一整套特殊DNA聚合酶SOS修复酶类，催化空缺部位DNA合成，这时补上去核苷酸几乎是随机，但依然保持了DNA双链完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高突变率。69/75DNA碱基序列发生可遗传永久性改变称为突变（mutation）。（三）DNA突变

突变意义：突变是进化、分化分子基础；突变造成基因型改变；突变造成死亡；突变是一些疾病发病基础。70/75DNA分子上单一碱基改变称点突变（pointmutation）1.置换（replacement）：（1）转换（transition）：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。（2）颠换（transversi