理论课21第二十一章 免疫学检测原理

第二十一章免疫学检测原理第一节免疫细胞的检测

一、免疫细胞的分离和纯化二、淋巴细胞及亚群的检测三、免疫细胞的功能测定第二节免疫分子的检测

一、免疫球蛋白的测定二、补体测定三、细胞因子及其受体的检测四、黏附分子的检测第三节免疫学检测常用的标记技术一、免疫荧光技术二、放射免疫测定三、免疫酶标技术1免疫学检测技术：包括细胞、分子、相关基因三个水平细胞水平检测：根据免疫细胞膜表面表达的独特标志及特殊功能，测定各类细胞及其亚群数量及效应，籍以了解细胞免疫水平分子水平检测：测定各类Ig、补体、CK及受体、黏附分子水平及生物学活性，籍以了解各类免疫因子间的相互关系基因水平检测：测定免疫应答相关基因的表达与调控，免疫分子的遗传多态性及基因型别分析2

第一节免疫细胞的检测

一、免疫细胞的分离和纯化依据细胞独特的表面标志、理化性质及黏附吞噬能力等差异设计不同方法，按不同实验目的、拟分离细胞的种类、纯度和数量等，选择方法（一）白细胞的分离根据红、白细胞比重、沉降速度不同分离1、自然沉降法：肝素抗凝外周血放置，红细胞沉降速度快，自然分离2、高分子聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮可使红细胞成钱串状凝集，加速沉降3（二）外周血单个核细胞（PBMC）的分离

PBMC包括淋巴细胞和单核细胞，人PBMC来源于外周血，动物大、小鼠单个核细胞来源于脾脏、淋巴结（MNC）。

标本：人肝素防凝外周血；鼠脾脏、淋巴结,机械研磨过100目网单个细胞悬液。密度梯度离心法：红细胞和多核细胞密度为1.092，PBMC为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035；聚蔗糖-泛影葡胺（F-H）分层液法：原理：F-H分层液密度为1.077，将PBMC层加于分层液上离心不同层次液体和细胞区带4（三）淋巴细胞的纯化与亚群分离1、去除红细胞：低渗溶解；0.89%氯化铵处理法2、去除单核、粒细胞：PBMC玻璃、塑料平皿黏附去除3、尼龙毛柱分离法：B细胞易黏附尼龙毛，过尼龙毛柱可分离

T、B细胞4、流式细胞术分选法：基本原理：流式细胞仪可快速、灵敏和高度自动化地对单个细胞进行多参数定量测定分析，从而分选特异性荧光抗体标记的阳性细胞（四）单核/巨噬细胞的分离和收集1、平皿黏附分离法2、斑蝥敷贴法：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷前臂内侧皮肤，诱发无菌皮炎，收集皮泡渗出液中来自皮下组织的3、硫基乙醇酸盐肉汤培养基小鼠腹腔收集腹腔渗出5二、淋巴细胞及亚群的检测根据细胞表面标志鉴定淋巴细胞亚群及检测计数1、T细胞检测1）间接免疫荧光法：原理：抗CD抗体与PBMC结合加入荧光素标记的羊/兔抗小鼠IgG抗体(荧光标记二抗)荧光显微镜计数2）免疫组织化学法：原理：酶标记抗体与组织切片或细胞涂片反应,结合加入底物酶催化底物显色普通光学显微镜检测表面标志鉴定细胞种类、亚群2、B细胞检测1）膜表面免疫球蛋白（SmIg）检测：应用抗Ig抗体借助直接免疫荧光法或免疫组织化学法检测2）间接免疫荧光法,同T细胞6三、免疫细胞的功能测定（一）吞噬细胞功能测定：1、中性粒细胞趋化功能测定滤膜渗透法（Boyden小室法）：上室加待测细胞，下室加趋化成分，中间用微孔滤膜隔开反应滤膜清洗、固定、染色透明普通光学显微镜观察细胞穿膜移动距离判断趋化功能2、中性粒细胞吞噬杀菌功能测定

NBT（硝基蓝四氮唑还原）试验：原理：中性粒细胞吞噬杀菌代谢释放氢摄入的NBT接受胞浆沉积黑色颗粒10%NBT+73、巨噬细胞吞噬功能测定：原理：用斑蝥酒精浸出液贴敷法收集人，用腹腔渗出法收集鼠，体外进行鸡红细胞(有胞核)吞噬实验，计算吞噬百分率、吞噬指数4、巨噬细胞细胞毒测定：测定对放射性核素51Cr、

125IUdR

标记靶细胞P815的杀伤活性51Cr标记靶细胞：51Cr渗透入细胞浆，细胞破坏释放51Cr

于上清中

125IUdR标记靶细胞：125IUdR掺入细胞DNA，细胞破坏酶切DNA释放125I于细胞沉淀中将效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶细胞破坏释放核素测定上清/细胞沉淀放射性强度（cpm）按公式计算杀伤百分率8（二）T细胞功能测定1、T细胞增生（转化）实验：原理：T细胞受到丝裂原刺激增生反应形态变化淋巴母细胞：体积大，染色质疏松，核仁明显等丝裂原：PHA、ConA（鼠）、PWM等1）放射性核素（3HTdR、125IUdR）掺入法：原理:细胞增生摄取3HTdR/125IUdR测放射性强度计算转化率、刺激指数2）细胞能量代谢测定（MTT四氮唑盐比色法）：原理：活细胞摄入MTT腺粒体作用胞内、胞周蓝黑色甲臜溶解甲臜酶标仪检测A值，计算转化率、刺激指数。甲臜生成量与细胞代谢活跃程度呈正比，间接定量分析细胞增生水平92、T细胞细胞介导的细胞毒实验原理

①CTL来源：免疫动物的脾脏或腹腔渗出液；将脾细胞与刺激细胞共育，体外诱生CTL②刺激细胞：预处理后无增殖能力，仍保持免疫源性的细胞③检测CTL细胞毒活性：形态学法；51Cr、125IUdR释放法；流式细胞术等。靶细胞为免疫用细胞/不处理的刺激细胞

51Cr、125IUdR释放法:效/靶按一定比例混合效/靶相互作用靶细胞破坏释放核素测定上清/细胞沉淀放射性强度（cpm）按公式计算杀伤百分率103、T细胞功能的体内检测法接触性超敏反应：用于研究免疫调节药物对细胞免疫的影响某些半抗原涂小鼠皮肤致敏再次接触半抗原活化的

CD4+TCK接触性皮炎11（三）B细胞功能测定1、B细胞增生实验：方法原理与T细胞同，但丝裂原为PWM，

LPS（鼠），SPA金葡菌，抗IgM抗体等2、溶血空斑形成实验：原理：SRBC免疫小鼠取脾制成单个细胞与SRBC在琼脂糖凝胶中混合注入平皿或玻片脾细胞中抗体生成细胞释放抗SRBC抗体（溶血素）与周围

SRBC结合加入补体抗体生成细胞周围溶血肉眼可见的溶血空斑，每空斑代表1个抗体生成细胞空斑计数3、酶联免疫斑点法（ELISPOT）：原理：已知抗原包被于固相载体加入待测抗体生成细胞释放特异性抗体结合抗原抗体生成细胞结合于固相载体加入酶联二抗与结合于固相载体的细胞上抗体结合加底物显色反应着色的斑点形成细胞镜检计数斑点（计算机软件计算、统计）12（四）NK细胞活性测定：靶细胞：人K562；鼠YAC-11、放射性核素释放法：51Cr、125IUdR标记靶细胞效/靶相互作用靶细胞破坏释放核素测定上清/细胞沉淀放射性强度（cpm）公式计算NK杀伤百分率2、酶释放法：原理：效/靶相互作用靶细胞破坏释放乳酸脱氢酶（LDH）

加底物显色取上清比色测LDHA值（光密度值）

公式计算NK杀伤百分率3、流式细胞术：原理：碘化丙叮（PI）与死亡靶细胞DNA/RNA

结合

激发荧光

流式细胞仪检测靶细胞死亡率13

第二节免疫分子的检测一、免疫球蛋白的测定常用方法：单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法免疫化学自动分析仪测定二、补体测定血清总补体活性测定CH50

原理：应用兔抗SRBC抗体-SRBC免疫复合物激活待测血清中补体经典途径SRBC溶血以50%溶血为判定结果的终点，称CH50。诊断总补含量减少或补体成分缺失

14—（三）补体各种成分测定C1q、C3、B、C1INH

单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法

ELISA（酶免疫吸附检测）、RIA（放射免疫测定）（四）补体裂解产物测定C3a、C3d、C5a

免疫电泳、交叉免疫电泳、ELISA、RIA

用于某些疾病诊断和病情监测（五）补体受体（CR）测定酶\荧光素\胶体金标记抗CR抗体等诊断补体受体缺陷15三、细胞因子及其受体的检测（一）CK生物学活性检测法原理：根据CK特定的生物学活性，采用相应的检测系统（各种依赖性细胞株/靶细胞），通过与标准品比对，判定样品中CK活性，用活性单位（U/ml）表示1、细胞增生或增生抑制法：原理：用对特定CK依赖/抑制的细胞株与待测CK培养，检测细胞增生或增生抑制，与标准品比对判断活性单位。如IL-2，TGF-。用3HTdR掺入法，MTT法3、细胞毒活性测定：原理：以结晶紫染色法、MTT法等测TNF

对特定靶细胞（L929、WEHI164.13）的细胞毒活性4、细胞病变抑制法：原理：以VSV-WISH（人）、VSV-L929（鼠）系统，检测IFN对VSV易感细胞株的50%病变抑制效应与标准品比对，判定活性单位16（二）CK免疫学检测

ELISA、免疫PCR、RIA、免疫印迹法（三）CKR检测

RIA、标记的抗CKR单抗法；

ELISA检测sCKR四、黏附分子的检测（一）细胞表面AM检测间接免疫荧光法、流式细胞术、

ELISA、RIA法等（二）可溶性AM检测

ELISA法17

第三节免疫学检测常用的标记技术一、免疫荧光技术基本原理：以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定（一）免疫荧光显微技术荧光显微镜观察1、直接免疫荧光法：特异性抗体直接检抗原检出荧光+细胞2、间接免疫荧光法：二抗标荧光检出荧光阳性细胞（二）流式细胞术（FCM）

流式细胞仪1、分析单个细胞表面标志2、分选收集不同类型细胞3、对同一细胞进行多参数如DNA、RNA、蛋白质、细胞体积等信息分析18二、放射免疫测定（RIA）

放射性检测仪器以放射性核素为示踪剂的免疫标记技术，将核素分析的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性相结合（一）RIA

原理：以放射性核素标记的抗原（Ag٭）和待测的未标记抗原与固定量的特异性抗体竞争结合，或进行竞争抑制反应当Ag٭和Ab量固定时，Ag٭-Ab形成量受Ag含量制约；若Ag量高时Ag-Ab,Ag٭-Ab,Ag٭-Ab形成量与未标记Ag呈负相关关系,即放射性(cpm)待测Ag含量，cpm

待测Ag含量（二）免疫放射测定（IRMA）

原理：将待测Ag与过量Ab٭反应

Ag-Ab٭

加入固相AgAg-Ab٭和固相Ag-Ab

离心沉淀去除固相Ag-Ab

检测上清Ag-Ab٭cpm

推算待测Ag含量19三、免疫酶标技术基本原理：以酶标抗体/抗原与细胞/组织中抗原/抗体结合，通过相应酶底物的显色反应，对待检细胞/组织中抗原-抗体定位、定性分析，亦可据显色深浅定量分析（一）酶免疫组织化学技术（EIH）

通过底物被酶显色示踪组织中抗原-抗体结合物的存在

普通光镜、电镜观察

ABC法：用生物素(B)标记过氧化物酶，可携带多个酶分子，可提高酶反应敏感性。将亲和素(A)与生物素(B)标记的过氧化物酶结合，形成可溶性亲和素-生物素化过氧化物酶复合物(ABC)

检测时，将生物素(B)标记抗体/二抗结合于标本加入ABCABC上的亲和素(A)结合于抗体的生物素(B)ABC结合于标本