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文档简介

第第页实验八感受态细胞的制备与转化基因工程转化

试验八

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

基因工程转化

试验目的

1.了解转化的概念及其在分子生物学讨论中的意

义。

2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

基因工程转化

试验原理

转化(Transformation)是将异源DNA分子引

入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性

状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、

基因工程等讨论的基本试验技术。

基因工程转化

转化中的受体细胞

转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰

系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲

基化酶的突变株，常用RM符号表示。

基因工程转化

试验原理

转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生改变，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子的受体细胞(Transformant)。

基因工程转化

试验原理

本试验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培育基上培育，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞那么因无反抗氨苄青霉素的技能而死亡。

基因工程转化

抗Amp

宿主细菌

含Amp培育基

基因工程转化

影响转化率的因素

细胞生长状态和密度。

转化的质粒DNA的质量和浓度。

试剂的质量。

防止杂菌和其它外源DNA的污染。

基因工程转化

试验仪器

基因工程转化

超净工作台

基因工程转化

台式高速冷冻离心机

基因工程转化

恒温空气摇床

基因工程转化

恒温培养箱

培养皿

基因工程转化

试验试剂

大肠杆菌DH5αLB培育基，0.1mol/LCaCl2溶液〔预冷〕氨苄青霉素pUC18质粒

基因工程转化

试验步骤

菌株活化感受态细胞制备外源DNA的转化

基因工程转化

试验步骤

菌株活化

1.

用接种环径直取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培育16小时

2.

挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培育基中，于37℃培育3－5小时

将培育液全部转到100mlLB培育基中培育2－3小时，到OD600＝0.3－0.4

3.

基因工程转化

试验步骤

感受态细胞制备

4.

将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min

5.6.

4000rpm离心5min,弃上清

加入0.8ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min4000rpm离心5min,弃上清加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使

7.8.

用。也可加入总体积15％的甘油

存

可－70℃长期保

基因工程转化

试验步骤

转化取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置3

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