生物化学的生物合成和加工

关于生物化学的生物合成和加工转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。

转录RNADNA

经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和hnRNA第2页,共90页，2024年2月25日，星期天参与转录的物质原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:

RNA聚合酶(RNA-pol)其他蛋白质因子第3页,共90页，2024年2月25日，星期天主要内容第一节模板和酶第二节转录过程第三节转录后加工第四节RNA复制和逆转录第4页,共90页，2024年2月25日，星期天模板和酶第一节第5页,共90页，2024年2月25日，星期天一、转录模板DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作负链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为正链。

第6页,共90页，2024年2月25日，星期天5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C编码链模板链mRNA蛋白质转录翻译第7页,共90页，2024年2月25日，星期天5

3

3

5

模板链编码链编码链模板链结构基因转录方向转录方向第8页,共90页，2024年2月25日，星期天不对称转录

在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。5'

3'

3'

5'

模板链（含结构基因）编码链第9页,共90页，2024年2月25日，星期天二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶第10页,共90页，2024年2月25日，星期天核心酶全酶

此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。第11页,共90页，2024年2月25日，星期天ω亚基由基因rpoZ编码，Mr为1.10×104，曾长期被忽略，甚至许多人不把它作为聚合酶的组分。然而，现在已经肯定，ω亚基是嗜热水生菌RNApol必不可少的组分，也是体外变性的RNApol成功复性所必需的，它与β亚基一起构成催化中心，稳定其与β'亚基的结合。第12页,共90页，2024年2月25日，星期天E.coli不同σ因子的性质与功能比较第13页,共90页，2024年2月25日，星期天（二）真核生物的RNA聚合酶(458)

第14页,共90页，2024年2月25日，星期天三、启动子和转录因子原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游的调控序列。

5

3

3

5

结构基因调控序列RNA-polRNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，称为启动子(promoter)。第15页,共90页，2024年2月25日，星期天LOREMIPSUMDOLORRNA聚合酶起始转录需要的辅助因子（蛋白质）称为转录因子(transcriptionalfactor)。第16页,共90页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶保护法第17页,共90页，2024年2月25日，星期天第18页,共90页，2024年2月25日，星期天开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物启动子保守序列RNA-pol辨认位点(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保护区结构基因3

3

RNA聚合酶全酶结合位点第19页,共90页，2024年2月25日，星期天第20页,共90页，2024年2月25日，星期天转录过程

第二节第21页,共90页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌RNA聚合酶的作用起始阶段：在DNA分子上搜索启动子，并将DNA双螺旋解开一小段。延伸阶段：选择正确的核苷三磷酸（NTP），催化磷酸二酯键的形成。终止阶段：检测RNA合成的终止信号，停止RNA的合成。特点：不需引物；无核酸外切酶活性。错误率高：1/104~105核苷酸,是DNA复制的105倍。第22页,共90页，2024年2月25日，星期天（一）转录起始转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。一、原核生物的转录过程第23页,共90页，2024年2月25日，星期天RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合第24页,共90页，2024年2月25日，星期天2.DNA双链解开，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链）

1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合5

-pppG-OH+

NTP

5

-pppGpN

-OH3

+ppi转录起始过程3.第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。4.第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3'羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。第25页,共90页，2024年2月25日，星期天

因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。

RNApol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

转录起始复合物:第26页,共90页，2024年2月25日，星期天（二）转录延长1.

亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断沿5'→3'方向延长。(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1

+PPi第27页,共90页，2024年2月25日，星期天

DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时，RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持约17个碱基对的长度。第28页,共90页，2024年2月25日，星期天转录空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA····RNA第29页,共90页，2024年2月25日，星期天RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链编码链模板链延长部位第30页,共90页，2024年2月25日，星期天

RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的恢复，RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定一小段。第31页,共90页，2024年2月25日，星期天5

3

DNA原核生物转录过程中的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶第32页,共90页，2024年2月25日，星期天依赖Rho(ρ)因子的转录终止不依赖Rho因子的转录终止（三）转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类第33页,共90页，2024年2月25日，星期天ATP1.依赖Rho因子的转录终止第34页,共90页，2024年2月25日，星期天ρ因子是ρ基因编码的蛋白质，是一种酶，在水解ATP的情况下，它沿着5′→3′方向转录物的3′端前进，直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶。随后ρ因子通过解链酶的活性解开转录泡（transcriptionbubble）上的RNA/DNA形成的杂交双螺旋，使RNA转录物得到释放，从而终止转录。

依赖ρ因子（rhofactor）的终止子第35页,共90页，2024年2月25日，星期天2.不依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。第36页,共90页，2024年2月25日，星期天这类终止子结构上有2个特征

（2）发夹结构末端紧跟6个连续的U，这发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，RNA链的合成就终止，酶和mRNA就从模板DNA上释放。

（1）DNA链的3′端附近有回文结构，富含G-C碱基，随后紧跟的是A-T碱基，转录而形成的RNA具有茎环的发夹形结构。

不依赖于ρ因子的终止第37页,共90页，2024年2月25日，星期天回文结构AT富集区GC富集区不依赖ρ因子的终止子结构第38页,共90页，2024年2月25日，星期天茎环结构使转录终止的机理

使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。5´pppG53

35RNA-pol第39页,共90页，2024年2月25日，星期天RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段5

3

RNA

启动子（promoter)

终止子(terminator)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

离开第40页,共90页，2024年2月25日，星期天二、真核生物的转录过程（一）转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。第41页,共90页，2024年2月25日，星期天TATA盒CAAT盒GC盒

增强子

顺式作用元件

结构基因-GCGC---CAAT---TATA转录起始真核生物启动子保守序列1.

转录起始前的上游区段第42页,共90页，2024年2月25日，星期天转录起始点TATA盒CAAT盒GC盒

增强子顺式作用元件(cis-actingelement)AATAAA切离加尾转录终止点修饰点外显子翻译起始点内含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚体第43页,共90页，2024年2月25日，星期天2.

转录因子

能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，或具有识别RNA聚合酶的作用，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。又称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。

第44页,共90页，2024年2月25日，星期天3.转录起始前复合物(PIC)

真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子帮助间接结合到DNA分子上。第45页,共90页，2024年2月25日，星期天POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化转录的起始前复合物Pol-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-P起始前复合物组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化RNA-PolⅡ羧基端结构域第46页,共90页，2024年2月25日，星期天（二）转录延长真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。第47页,共90页，2024年2月25日，星期天5------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点5

5

3

33加尾AAAAAAA······3mRNA（三）转录终止——和转录后修饰密切相关。第48页,共90页，2024年2月25日，星期天DNA复制与转录的比较性质

复制

转录相同点模板两股DNA单链均作为模板为模板链原料dNTPNTP合成方式半保留复制不对称转录聚合酶种类

DNA聚合酶RNA聚合酶RNA引物需要不需要产物半保留的双链DNA单链RNA不同点需要DNA为模板需要核苷三磷酸为原料遵循碱基配对原则新链合成方向均为5’→3’第49页,共90页，2024年2月25日，星期天1.嘌呤和嘧啶类似物

核酸代谢的拮抗物：抑制核酸合成有关的酶掺入核酸分子形成异常核酸如：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、

8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用

三、RNA生物合成的抑制剂P469第50页,共90页，2024年2月25日，星期天2.DNA模板功能的抑制物（1）烷化剂（2）放线菌素D（actinomycinD）

与DNA形成非共价复合物其作用如同阻遏蛋白抑制DNA转录和复制。

色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素（3）嵌入染料

使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸，导致移码突变，并能抑制RNA链的起始。第51页,共90页，2024年2月25日，星期天利福平抑制细菌RNA聚合酶活性第52页,共90页，2024年2月25日，星期天某些常用的转录抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与β亚基结合阻止起始利链霉素细菌的核心酶与β亚基结合阻止延长放线菌素D真核DNA与DNA结合并阻止延长α-鹅膏蕈碱真核RNAPolⅡ与RNA聚合酶Ⅱ结合第53页,共90页，2024年2月25日，星期天转录后加工第三节第54页,共90页，2024年2月25日，星期天几种主要的修饰方式1.拼接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修饰(modification)4.

添加(addition)第55页,共90页，2024年2月25日，星期天tRNA和rRNA被加工的证据

rRNA和tRNA有以下三点特性：1）所有RNA初级转录产物的5`末端均是5`-三磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子的5`末端是5`单磷酸；2）rRNA和tRNA分子比初级转录产物小很多；3）所有tRNA含有稀有碱基。

第56页,共90页，2024年2月25日，星期天（一）rRNA的加工

原核生物rRNA转录初始物:rRNA基因和tRNA基因组成混合操纵子：

16SrDNA23SrDNA5SrDNAtDNA加工RNA酶Ⅲ对转录初始物切割再加工成熟原核生物的转录后加工原核生物有7个rRNA转录单位第57页,共90页，2024年2月25日，星期天RNaseⅢRNaseⅢRNaseE甲基化碱基甲基化核糖第58页,共90页，2024年2月25日，星期天(二)tRNA的加工

大肠杆菌染色体有tRNA基因约60个原核生物tRNA转录初始物:tRNA基因:◆Ⅰ型---tRNA有3’-CCA-OH◆Ⅱ型---tRNA无3’-CCA-OHtRNA转录初始物:◆与rRNA相连◆几个相同(不同)tRNA连在一起多顺反子转录单位第59页,共90页，2024年2月25日，星期天●加工RNA酶ⅢRNA酶FRNA酶DRNA酶PtRNA核苷转移酶切开rDNA、tDNA转录产物

间隔序列从3’端切断前体分子核酸外切酶,切除Ⅰ型tRNA3’-CCA-OH下游序列（核酸+蛋白）（M1RNA）内切酶，tRNA5’端成熟酶

催化Ⅱ型tRNA形成稳定的3’-CCA-OH“斩头”，去尾，剪接，3’-末端添加，化学修饰第60页,共90页，2024年2月25日，星期天原核生物tRNA前体分子的加工b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修饰：形成稀有碱基如DH2。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC

表示核酸内切酶的作用表示核苷酸转移酶的作用

表示核酸外切酶的作用

表示异构化酶的作用第61页,共90页，2024年2月25日，星期天（三）mRNA的加工原核细胞的mRNA通常没有转录后的加工过程。第62页,共90页，2024年2月25日，星期天真核生物的转录后加工第63页,共90页，2024年2月25日，星期天4种rRNA，是两个转录单位。18S、5.8S和28SrRNA的前体是45S（一个转录单位）。5SrRNA是单独的一个转录单位。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。一、rRNA的转录后加工第64页,共90页，2024年2月25日，星期天40S亚基60S亚基大多数真核细胞为成熟的28S18S5.8SrRNA的共同前体rRNA

由核酶催化进行自身剪接第65页,共90页，2024年2月25日，星期天转录45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA内含子内含子28S5.8S18S32S多数真核生物的rRNA基因不存在内含子，有些含有内含子但并不转录，如果蝇。四膜虫可以自动切去内含子第66页,共90页，2024年2月25日，星期天tRNA前体RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA二、tRNA的转录后加工RNA聚合酶Ⅲ催化合成第67页,共90页，2024年2月25日，星期天RNAaseP、内切酶第68页,共90页，2024年2月25日，星期天tRNA核苷酸转移酶、连接酶ATPADP第69页,共90页，2024年2月25日，星期天碱基修饰（2）还原反应如：UDHU

（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：A

I

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）约有10%需要酶促修饰第70页,共90页，2024年2月25日，星期天三、真核生物mRNA的转录后加工核内的初级mRNA称为核不均一RNA(hnRNA)定义：mRNA的原初转录物是相对分子量极大的前提，在核内加工过程中形成大小不等的中间体，即hnRNA特点：平均分子长度为8-10Kb左右。比mRNA的平均长度(1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。第71页,共90页，2024年2月25日，星期天LOREMIPSUMDOLORhnRNA是mRNA的前体，证据是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；

(3)两者5′端都有帽子结构，表明二者为相同的聚合酶所合成；

(4)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。第72页,共90页，2024年2月25日，星期天（一）首、尾的修饰5

端形成帽子结构(m7GpppGp—)3

端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)加工过程包括：首、尾、剪接、甲基化第73页,共90页，2024年2月25日，星期天帽子结构(m7GpppGp—)

第74页,共90页，2024年2月25日，星期天5pppGp…5GpppGp…pppGppi鸟苷酸转移酶5

m7GpppGp…甲基转移酶SAM帽子结构的生成5ppGp…磷酸酶Pi以5’-5’三磷酸相连作用:稳定mRNA5’端和翻译的起始有关第75页,共90页，2024年2月25日，星期天步骤1步骤2作用位置加尾:3

端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)

作用：稳定mRNA，mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式第76页,共90页，2024年2月25日，星期天四、RNA生物功能的多样性（核酶）具有酶促活性的RNA称为核酶。核酶(ribozyme)Cech和Altman获得了1989年度的诺贝尔化学奖第77页,共90页，2024年2月25日，星期天四膜虫rRNA内含子的二级结构四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接方式5´-端核苷酸序列第78页,共90页，2024年2月25日，星期天最简单的核酶二级结构——锤头状结构(hammerheadstructure)底物部分通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份组成锤头结构除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。第79页,共90页，2024年2月25日，星期天核酶研究的意义核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。第80页,共90页，2024年2月25日，星期天第四节

RNA复制和逆转录(P491)第81页,共90页，2024年2月25日，星期天

RNA的复制是指

病毒基因组RNA的复制(真核生物RNA的复制只是极个别的现象)

概念:由RNA复制酶(RNAreplicase)催化,以病毒RNA为模板的RNA合成。

RNA病毒在宿主细胞内繁殖时,即进行RNA复制。一、RNA的复制第82页,共90页，2024年2月25日，星期天