天然药物提取方法

关于天然药物提取方法基本操作技术与应用天然药物活性成分的研究（了解内容）天然产物的提取方法（掌握内容）天然产物的分离方法（掌握内容）色谱分离法（掌握内容）天然产物的结构测定（熟悉内容）第2页,共86页，2024年2月25日，星期天研究途径临床调查收集原料成分提取分离成分预试验活性筛选文献资料调研结构确定动物试验临床试验第3页,共86页，2024年2月25日，星期天提取的基本知识什么是提取？提取的思路（已知成分、未知成分）提取前预处理（一般过2号筛为宜，同时注意酶的影响）基本原理—相似相溶影响因素（溶剂的选择、方法选择、时间、温度、粉碎度等）极性第4页,共86页，2024年2月25日，星期天极性常用溶剂极性排列顺序：石油醚<苯<无水乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水官能团的极性排列顺序：烷烃<卤代烃<醚<酯<酮<醛<酰胺<胺<醇<水<酚<羧酸第5页,共86页，2024年2月25日，星期天溶剂分类与特点（一）水：价廉，安全，对细胞的穿透能力强。适用于无机盐、糖类、鞣质、氨基酸与蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类化合物的提取。亲水性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮等。特点：可与水任意比混溶，毒性低、价廉、回收方便，对细胞的穿透能力强。适用于多种成分的提取，其中，乙醇又称为“万能溶剂”。第6页,共86页，2024年2月25日，星期天溶剂分类与特点（二）亲脂性有机溶剂：石油醚、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等。特点：选择性强、回收方便、但易燃、有毒、价贵。适用于挥发油、油脂、叶绿素、树脂、游离生物碱、苷元等成分的提取。第7页,共86页，2024年2月25日，星期天提取技术与方法（一）溶剂法：仅限于低分子量、含量高的成分的提取。根据“相似相溶”的原则进行提取。（二）其他方法根据化合物的特殊性质选择特殊的提取方法。水蒸气蒸馏法升华法共9种方法第8页,共86页，2024年2月25日，星期天溶剂提取法浸渍法渗漉法煎煮法回流法连续回流法超声提取法超临界流体萃取法第9页,共86页，2024年2月25日，星期天浸渍法分为冷浸法（室温）和温浸法（40~60℃）。常用溶剂：水、酸水、碱水、稀醇等。适用于遇热易被破坏的成分或含大量淀粉、粘液质、果胶、树胶等多糖类成分的提取。缺点：提取时间长、溶剂用量大、提取效率低、用水作溶剂时易发霉。第10页,共86页，2024年2月25日，星期天渗漉法适用范围与提取溶剂同浸渍法。步骤：浸润、装筒、排气、浸渍、渗漉。优点：提取效率较高。缺点：提取时间长、溶剂用量大。第11页,共86页，2024年2月25日，星期天煎煮法药房及家庭中最为常用的中药提取方法。常用溶剂：水适用于对热稳定的成分的提取。含多糖类成分量大的药材因煎煮后呈糊状，不宜用本法。第12页,共86页，2024年2月25日，星期天回流法最常用的提取方法。对热不稳定的成分不适用。提取效率较高。选择什么试剂？适用于什么成分？第13页,共86页，2024年2月25日，星期天连续回流法浸渍法和回流法的特点兼有。对热不稳定的成分慎用。提取时间长。第14页,共86页，2024年2月25日，星期天超声提取法利用超声波振动产生的能量在提取液中产生“空化现象”提取有效成分。优点：操作简便，几乎适用于各种溶剂的提取，提取时间短，效率高。第15页,共86页，2024年2月25日，星期天超临界流体萃取法超临界流体（supercriticalfluid，SF）：当某物质处于临界温度和临界压力以上时可形成一种既非液体又非气体的单一相态，将这一状态的物质称为超临界流体。目前最常用的是CO2-SFE技术。第16页,共86页，2024年2月25日，星期天水蒸气蒸馏法适用于具有挥发性，可与水蒸气一起蒸馏出来，与水不反应，又难溶于水的化合物的提取。第17页,共86页，2024年2月25日，星期天升华法适用于有升华性，升华温度适当，遇热较稳定的化合物的提取。可分为常压升华和减压升华两种。第18页,共86页，2024年2月25日，星期天关于提取问题小结极性（溶剂的极性、化合物的极性）提取溶剂的分类与特点提取的原理提取的方法与适用范围第19页,共86页，2024年2月25日，星期天分离方法（一）分离前处理（二）结晶与重结晶（三）分离方法系统溶剂分离法两相溶剂萃取法沉淀法6.透析法9.色谱法吸附法（补充）7.分馏法盐析法（补充）8.升华法第20页,共86页，2024年2月25日，星期天分离前处理提取液一般体积较大，目标成份浓度低，需要先浓缩提高浓度，然后再进行分离工作。浓缩的方法常压蒸馏减压蒸馏薄膜蒸发第21页,共86页，2024年2月25日，星期天常压蒸馏适用于有效成分受热不易分解，低沸点有机溶剂（氯仿、乙醚、石油醚等）的提取液的浓缩。第22页,共86页，2024年2月25日，星期天减压蒸馏适用于溶剂沸点高，有效成分受热易分解的提取液的浓缩。第23页,共86页，2024年2月25日，星期天薄膜蒸发浓缩效率高，受热时间短，特别适用于浓缩水或稀醇为溶剂的提取液。第24页,共86页，2024年2月25日，星期天结晶与重结晶（一）结晶的条件（掌握)（二）结晶溶剂的选择(熟悉）（三）制备结晶的方法

1.晶核的形成

2.晶链的延长（四）结晶纯度的判断(重点掌握）第25页,共86页，2024年2月25日，星期天结晶的条件被分离化合物纯度高；呈过饱和状态；最适结晶温度：5~10℃；充分放置。第26页,共86页，2024年2月25日，星期天结晶溶剂的选择（理想溶剂）一不与结晶物质起化学反应；杂质与结晶物质在溶剂中的溶解度相差大；目的物在溶剂中的溶解度随温度不同有显著差别；溶剂沸点不宜太高或太低（可在60℃）；溶剂沸点低于化合物的熔点；溶剂沸点低于结晶温度；能给出较好的晶形，无剧毒。第27页,共86页，2024年2月25日，星期天结晶溶剂的选择二常用溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等。其他不常用溶剂：二甲基亚砜、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺、冰醋酸等。混合溶剂？如何选择与使用水--乙醇；乙醇—乙醚；石油醚—苯；水—丙酮；乙醚—乙酸乙酯—乙醇等。第28页,共86页，2024年2月25日，星期天结晶纯度的判断一定的晶形、均匀的色泽；有固定的熔点，熔距较小；TLC：经过三种以上展开剂展开得均一圆形的斑点。第29页,共86页，2024年2月25日，星期天系统溶剂分离法目前是研究成分不明的天然产物的最常用方法。选择3~4种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步对粗提物进行分离。手续复杂、对化学性质不稳定，容易引起分解、异构化的产物应特别注意。第30页,共86页，2024年2月25日，星期天两相溶剂萃取法（一）基础知识原理分配系数与分离因子（二）萃取方法第31页,共86页，2024年2月25日，星期天基础知识一、原理利用混合物中各成分在两种互不混溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的目的。二、分配系数与分离因子分配系数（K）K=C有机相/C水相分离因子（β）β=KA/KB第32页,共86页，2024年2月25日，星期天假设KA=10，KB=0.1，则β=100当β≥100时，一次简单的萃取就可以完成分离；当10<β≤100，需萃取10~12次；当β≤2时，需要完成100次以上的萃取；当β≈1时，理论上无法完成萃取分离的目的。第33页,共86页，2024年2月25日，星期天萃取方法简单萃取法（掌握）pH梯度萃取法（重点掌握）（补充）逆流连续萃取法（了解）逆流分溶法（countercurrentdistributionCCD)（了解）液滴逆流分配法（dropletcountercurrentchromatogrophyDCCC）（了解）第34页,共86页，2024年2月25日，星期天简单萃取法适用于分离因子较大的情况的分离。提取液的密度最好在1.1~1.2。“等量多次”原则（掌握）乳化现象（熟悉）第35页,共86页，2024年2月25日，星期天等量多次原则证明设Vml水中含有Wg溶质，用Sml有机溶剂萃取后，在水中尚有W1g溶质没有被萃取出来，则分配系数KD为：整理得第36页,共86页，2024年2月25日，星期天第2次再用Sml有机溶剂萃取水中的溶质后仍有W2g没有被萃取出来，则因此，若每次用Sml有机溶剂萃取，最后剩在Vml水中的溶质Wn为若一次用nSml有机溶剂萃取，剩余在水中的溶质第37页,共86页，2024年2月25日，星期天结论用总量相同的溶剂，分多次萃取的效率要比1次萃取的效率高。第38页,共86页，2024年2月25日，星期天乳化现象产生原因天然产物中含有皂苷、蛋白质、植物胶质、鞣质等表面活性物质；两相互不相溶的溶剂；振摇；少量轻质的沉淀等。第39页,共86页，2024年2月25日，星期天解决方案较长时间静置；2.将乳状液分出，再换新溶剂萃取；3.将乳状液加温或冷冻；4.将乳状液抽滤；5.加入少量电解质（如NaCl等）；6.加入少量低级醇（如乙醇、戊醇等）。第40页,共86页，2024年2月25日，星期天pH梯度萃取法是分离酸性、碱性、两性有机化合物常用的手段。原理：由于溶剂系统PH的改变，改变了化合物的存在状态（游离型或解离型），从而改变了化合物在溶剂系统中的分配系数。酸性化合物：pH=pka-2游离；

pH=pka+2

解离。碱性化合物相反。第41页,共86页，2024年2月25日，星期天以酸性化合物HA为例酸性化合物在水中电离：电离常数取负对数第42页,共86页，2024年2月25日，星期天逆流连续萃取法操作简便；萃取完全，不易乳化；适合于两相互不混溶的溶剂的密度相差较大的系统的分离。第43页,共86页，2024年2月25日，星期天逆流分溶法（CCD)适用于性质相似的异构体或同系物的分离。特点：条件温和，样品易于回收。注意：溶质浓度越低分离效果越好。第44页,共86页，2024年2月25日，星期天液滴逆流分配法（DCCC）CCD的改进方法，不易乳化。特别适用于皂苷类化合物的分离。需要动力泵。第45页,共86页，2024年2月25日，星期天沉淀法可以分为酸碱沉淀、试剂沉淀、铅盐沉淀。酸碱沉淀：适用于酸性、碱性物质的分离。试剂沉淀沉淀试剂沉淀有机溶剂沉淀3.铅盐沉淀中性醋酸铅碱性醋酸铅第46页,共86页，2024年2月25日，星期天吸附法（补充）选择适宜吸附剂（如硅胶、Al2O3、活性炭）去除杂质或选择性筛选目标成分。如用活性炭去除在提取液中的叶绿素等脂溶性成分。第47页,共86页，2024年2月25日，星期天盐析法（补充）在水提液中加入NaCl、MgCl2等无机盐促进极性稍大组分析出的方法。如盐酸小檗碱易溶于热水，在冷水中溶解度小，但在结晶冷却过程中不易析出结晶，可通过加入NaCl固体的方法促进析晶。第48页,共86页，2024年2月25日，星期天透析法第49页,共86页，2024年2月25日，星期天色谱法吸附色谱(adsorptionchromatography)分配色谱/液相色谱(patitionchr.)离子交换色谱(ionexchangechr.)大孔吸附树脂法(macro-reticularresinemethod)凝胶色谱法(gelfiltrationchr.)气相色谱法(gaschromatography)高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography)第50页,共86页，2024年2月25日，星期天吸附色谱基本原理：利用混合物中不同组分分子、溶剂分子与吸附剂表面分子间的作用力不同，引起不同的吸附性能而进行分离。吸附剂色谱结果操作方式第51页,共86页，2024年2月25日，星期天

极性吸附剂：硅胶、氧化铝吸附剂非极性吸附剂：活性炭聚酰胺硅胶：微酸性，不宜直接用于碱性物质的分离。颗粒表面的硅醇基起吸附作用，需在105~110℃活化。氧化铝：微碱性，不宜直接用于含醛基、羰基、酯基化合物的分离。活性炭：多用于水提液中脂溶性杂质的分离。第52页,共86页，2024年2月25日，星期天4、聚酰胺：酰胺基可以与羟基、羧基、硝基等形成氢键。分离规律（P67）

：氢键越多，吸附越牢，Rf越小。如易形成分子内氢键，Rf增大。芳香化程度越高，吸附越牢。各种溶剂的洗脱能力：水<甲醇<丙酮<NaOH水溶液<甲酰胺<二甲基甲酰胺<尿素水溶液第53页,共86页，2024年2月25日，星期天操作方式薄层色谱（thinlayerchromatography,TLC)

操作步骤：制板点样展开定位柱色谱操作步骤：吸附剂与洗脱剂选择装柱上样洗脱分离注意活化第54页,共86页，2024年2月25日，星期天分配色谱（一）基本原理：根据被分离物质在两相中的溶解性不同而进行分离（CCD）。（二）正相色谱与反相色谱（掌握）（三）支持剂：硅藻土、纤维素粉、滤纸、含水17%的硅胶等。（四）操作方式

1.纸层析(PC)2.TLC3.柱层析第55页,共86页，2024年2月25日，星期天正相色谱：固定相的极性大于流动相的极性。固定相多为强极性溶剂，如水、缓冲液等。反相色谱：固定相的极性小于流动相的极性。固定相多为亲脂性溶剂。第56页,共86页，2024年2月25日，星期天支持剂的要求无吸附作用；不溶于两相溶剂中；不与被分离物质发生化学反应；并能吸着一定的固定相；可以使流动相自由通过而不改变其组成。第57页,共86页，2024年2月25日，星期天离子交换色谱（IEC）（一）分离原理：利用离子交换树脂在水溶液中可以解离，并与溶液中其它离子产生可逆性的交换，达到分离离子型化合物的目的。（二）离子交换树脂（熟悉）（三）分离结果（重点掌握）（四）离子交换树脂的选择（了解）（五）操作（了解）第58页,共86页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂阳离子交换树脂：能与溶液中阳离子进行交换，按交换活性分为强酸型阳离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂两类。如：RSO3H+NaClRSO3Na+HCl阴离子交换树脂：能与溶液中阴离子进行交换，按交换活性分为强碱型阴离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂两类。如：RNOH+NaClRNCl+NaOH第59页,共86页，2024年2月25日，星期天样品强酸型阳离子交换树脂酸性及中性物质强碱型阴离子交换树脂稀NH4OH洗脱洗脱液（碱性及两性）

中性物质稀碱洗脱洗脱液（酸性物质）强碱型阴离子交换树脂碱性物质稀酸洗脱洗脱液（两性物质）流出液流出液流出液第60页,共86页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂的选择根据被分离物质选择树脂，如分离生物碱选择阳离子交换树脂。根据被分离物质的解离常数选择，如碱性强选择弱酸型阳离子交换树脂。根据化合物大小选择，如分离大分子化合物可选择交联度3~6%的树脂。第61页,共86页，2024年2月25日，星期天操作预处理：水浸泡（溶胀）酸碱处理（洗去杂质）水洗至中性装柱上样与洗脱再生第62页,共86页，2024年2月25日，星期天大孔吸附树脂法

主要用于水溶性化合物的提取分离。大孔吸附树脂（吸附性与范德华力、氢键有关）大孔吸附树脂类型影响因素：1.分子极性大小；2.分子体积大小；3.pH值的影响。预处理与再生第63页,共86页，2024年2月25日，星期天大孔吸附树脂的特点吸附性和筛选性相结合的分离材料选择性好吸附容量大机械强度高再生处理方便吸附速度快解吸容易不易受到无机盐等离子或小分子化合物的影响第64页,共86页，2024年2月25日，星期天大孔吸附树脂类型非极性吸附树脂（芳香族吸附剂）：以苯乙烯为单体，二乙基苯为交联剂。中极性吸附树脂（脂肪族吸附剂）：以甲基丙烯酸酯作为单体和交联剂。极性吸附树脂：结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等极性基团。第65页,共86页，2024年2月25日，星期天预处理与再生预处理：水洗、溶胀后用甲醇或95%的乙醇浸泡24小时，至洗涤液加水后不呈白色浑浊，最后用蒸馏水洗掉有机溶剂。再生：蒸馏水、甲醇、乙醇反复洗涤，必要时可用3%的盐酸水溶液或3%的氢氧化钠溶液再生。第66页,共86页，2024年2月25日，星期天凝胶色谱法（GFC）原理：“分子筛”凝胶的种类1.葡聚糖凝胶（SephadexG）2.羟丙基葡聚糖凝胶（LH-20）第67页,共86页，2024年2月25日，星期天气相色谱法：适用于沸点低，易挥发，对热稳定的化合物的分离。HPLC电泳技术第68页,共86页，2024年2月25日，星期天结构测定(一)鉴定天然产物化学成分的一般步骤1.化合物纯度测定2.初步推测化合物类型3.测定分子式、计算不饱和度4.确定官能团或结构片断5.确定分子的平面结构6.确定分子的立体结构(二)结构测定中波谱知识回顾第69页,共86页，2024年2月25日，星期天纯度测定方法1.结晶的性质2.层析行为（PC、TLC）3.GC4.HPLC5.电泳……第70页,共86页，2024年2月25日，星期天分子式测定方法、不饱和度的计算分子式测定方法（MS）：1.元素定性分析2.高分辨质谱法（HR-MS)不饱和度的计算

U=(2+2n4+n3-n1)/2第71页,共86页，2024年2月25日，星期天例1：元素定性分析定量分析结果：C：79.35%，H：10.21%所以，O=100-79.35-10.21=10.44%三元素在结构中所占比例为：C=79.35/12.01=6.6110.16H=10.21/1.008=10.1315.58O=10.44/16.00=0.651分子式为（C10H16O1）n如MS的分子离子峰为456，则n=3第72页,共86页，2024年2月25日，星期天例2：高分辨质谱法以12C=12.000000为基准，1H=1.00782514N=14.00307，16O=15.99491故：C8H12N4164.1063C9H12N2O164.0950C10H12O2164.0837C10H16N2164.1315分子量均为164，但精确质量不一样，可用于区别化合物。第73页,共86页，2024年2月25日，星期天常用波谱知识回顾紫外光谱(UV)红外光谱(IR)核磁共振(NMR)质谱(MS)练习第74页,共86页，2024年2月25日，星期天紫外光谱用不同波长的紫外光为光源（200~400nm），依次照射一定浓度的样品溶液，分别测定其吸光度（A），并用波长对吸光度（或摩尔吸光系数）作图，得紫外吸收光谱图。应用：定性鉴别、纯度检查、单组分的定量分析以及结构解析（辅助手段）。只能显示分子中部分结构的特征。第75页,共86页，2024年2月25日，星期天可鉴定的结构片断某种发色团的存在；顺反异构体的鉴定；吸收带R带：杂原子的不饱和基团，波长>270nm,弱吸收；可随溶剂极性的不同而移动。K带：共轭结构，强吸收。B带：芳香化合物，似掌状，256nm左右，弱吸收。E带：芳香化合物，强吸收，可分为E1（180nm)和E2(200nm)两个峰。第76页,共86页，2024年2月25日，星期天红外光谱广泛用来鉴定化合物的结构，简单迅速，可靠。用波长2.5-15um（4000-667cm-1）的光波为光源依次照射样品，以波数（或波长）为横坐标，百分透光度为纵坐标绘制的谱图。与紫外光谱的区别：IR为振动-转动光谱适用范围广特征性强第77页,共8