犬瘟热诊断技术

中华人民共和国农业行业标准中华人民共和国农业部发布I本标准的附录A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出并归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、遇秀玲、陈西钊、王传彬。1本标准规定了犬瘟热(CD)的临床诊断、犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、免疫酶试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术。本标准适用于犬瘟热的诊断。2临床诊断要点2.1临床症状CD的临床表现多种多样，与CDV的毒力，环境条件，宿主的年龄、品种及免疫状态有关。病犬体温升高至40℃以上，鼻流清涕至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘疹。病程长的犬足枕角质层增生。病后期CDV侵害大脑时则出现神经症状，头、颈、四肢抽搐。2.2病理变化CDV为泛嗜性病毒，对上皮细胞有特殊的亲和力，因此病变分布非常广泛。新生幼犬感染CDV通常表现胸腺萎缩。成年犬多表现结膜炎、鼻炎、气管支气管炎和卡他性肠炎。表现神经症状的犬通常可见鼻和脚垫的皮肤角化病。中枢神经系统的大体病变包括脑膜充血，脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。CDV的包涵体通常呈嗜酸性，位于胞浆内，直径1μm～5μm,可在粘膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发现。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。3病毒分离与鉴定3.1材料准备3.1.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基，配方见第A.1章。3.1.1.2非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)。3.1.1.3标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024。3.1.1.4标准阴性血清：无CDV感染的犬血清。3.1.1.5新生牛血清处理：用无血清DMEM洗涤细胞两次，加入培养液二分之一量的新生牛血清，37℃吸附1h。吸附后的新生牛血清分装，置—20℃备用。3.1.1.6青霉素、链霉素。3.1.2器材a)细胞培养瓶；b)吸管；c)二氧化碳培养箱；d)37℃恒温水浴箱；e)普通冰箱及低温冰箱；f)离心机及离心管；g)研磨器械；h)普通光学显微镜；2i)微量加样器，容量5μL~50μL,50μL~200μL;j)0.45μm微孔滤膜。CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min,取上清。10000r/min离心20min,取上清用于CDV分离。3.2操作方法3.2.1细胞培养用含8%已处理的新生牛血清的DMEM培养基，在37℃培养Vero细胞。每3d～4d传代一次，3.2.2病料接种将0.1mL处理好的组织悬液接种Vero细胞，33℃吸附1h,加入无血清DMEM继续培养5d~7d,观察结果。3.2.3结果观察CDV感染Vero细胞4d~5d表现为细胞变圆、胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆中出现包涵体。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍将出现细胞病变的细胞培养物，按第4章的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗体进行鉴定。4免疫酶试验4.1材料准备4.1.1试剂4.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.2章。4.1.1.2抗原涂片的制备：将CDV接种Vero细胞，接种后5d～7d,病变达50%～75%时，用胰蛋白酶消化分散感染细胞，PBS洗涤三次后，稀释至1×10°个细胞/mL。取印有10个～40个小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮(4℃)固定10min。密封包装，置—20℃备用。4.1.1.3标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024。4.1.1.4标准阴性血清：无CDV感染的犬血清。4.1.1.5酶结合物：HRP标记的葡萄球菌A4.1.2器材a)普通光学显微镜；b)印有10个～40个小孔的室玻片；d)37℃恒温培养箱或水浴箱。4.1.3样品存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS作10倍稀释。4.2操作方法4.2.1取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，37℃30min。4.2.2PBS漂洗三次，每次5min,室温干燥。34.2.3滴加适当稀释的酶结合物，置湿盒内，37℃30min。4.2.4PBS漂洗三次，每次5min。4.2.5将室玻片放入底物溶液中，室温下显色5min~10min。PBS漂洗两次，再用蒸馏水漂洗一次。4.2.6吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。4.3结果判定4.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下：即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应重试。4.3.2待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为CDV抗体阴性。4.3.3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应呈棕黄色至棕褐色，即可判为CDV抗体阳性。5免疫酶组织化学法5.1材料准备a)磷酸盐缓冲液(PBS):配制见第A.1章。b)标准阳性血清：CDV单克隆抗体，中和抗体效价1:1024。c)标准阴性血清：无CDV感染的犬血清。d)酶结合物：HRP标记的SPA。e)过氧化氢甲醇溶液：配制见第A.4章。f)盐酸酒精溶液：配制见第A.5章。g)胰蛋白酶溶液：配制见第A.6章。h)底物溶液：配制见第A.3章。5.1.2器材a)普通光学显微镜；c)石蜡切片机或冷冻切片机；d)载玻片及盖玻片；e)37℃恒温培养箱或水浴箱。5.1.3样品对疑似CDV的病死犬或扑杀犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴结和脑等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即送检者，将组织块切成1cm×1cm左右大小，置体积分数为10%的福尔马林溶液中固5.2操作方法5.2.1新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min～15min;新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱蜡至PBS(切片应用白胶或铬矾明胶做粘合剂，以防脱片)。5.2.2去内源酶；用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液37℃作用20min。5.2.3胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min,以便充分暴露抗原。5.2.5封闭；滴加体积分数为5%的新生牛血清或1:10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用30min。5.2.6加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清，37℃湿盒中作用1h或37℃湿盒中作用30min后4℃过夜。5.2.7漂洗同5.2.4。45.2.8加适当稀释的酶结合物，37℃湿盒作用1h。5.2.9漂洗同5.2.4。5.2.10底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min～10min后漂洗。5.2.11衬染：苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞质。5.2.12从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。5.2.13试验同时设阳性对照和阴性对照。5.3结果判定阳性和阴性对照片本底清晰，背景无非特异着染，阳性对照组织细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染，试验成立；被检组织细胞胞浆、偶见胞核呈黄色至棕褐色着染，即可判为CDV抗原阳性。6综合判定当在临床上怀疑有CDV感染时，可根据实际情况在上述方法中选一种或两种方法进行确诊。对于未接种过CDV疫苗的犬，采用任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为CDV感染犬。对于接种过CDV疫苗的犬，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可最终判定为CDV感染犬；若仅血清学试验呈现阳性结果，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为CDV感染犬。(规范性附录)试剂的配制A.1DMEM(高糖)培养液的配制A.1.1量取去离子水950mL,置于适宜的容器中。A.1.2将DMEM粉剂10g加于30℃的去离子水中，边加边搅拌。A.1.3每1000mL培养液加3.7g碳酸氢钠。A.1.4加去离子水至1000mL,用1mol/L氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至pH6.9～7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。A.1.5立即用孔径0.45μm的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。A.2