第16周 第六章 分光光度法

2024/4/21Analyticalchemistry1分光光度法第六章2024/4/21Analyticalchemistry2教学指导：分光光度法简介分光光度法基本原理可见分光光度法及其仪器分光光度法应用2024/4/21Analyticalchemistry32024/4/21Analyticalchemistry4一、电磁辐射和电磁波谱1．电磁辐射（电磁波，光）：以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量2．电磁辐射的性质：具有波、粒二向性波动性：粒子性：光谱分析概论波动性：光以波的形式传播，可用波长、频率来表示。光速c=3×1010cm/s粒子性：光由光子组成，具有能量。h为普朗克常数6.63×10-34J.s2024/4/21Analyticalchemistry5

高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁

χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁3．电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长

波长逐渐增大2024/4/21Analyticalchemistry6二、光谱分析法及其分类1．光谱法：利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性、定量分析方法

按能量交换方向分吸收光谱法发射光谱法按作用结果不同分原子光谱→线状光谱分子光谱→带状光谱2024/4/21Analyticalchemistry73发射光谱2吸收光谱例：γ-射线；x-射线；荧光例：原子吸收光谱，分子吸收光谱2024/4/21Analyticalchemistry8分光光度法（AbsorptionPhotometry）：基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法。包括比色法、紫外可见分光光度法、红外分光光度法。广泛用于无机物和有机物的定性和定量分析。一分光光度法简介2024/4/21Analyticalchemistry9分光光度法特点：灵敏度高：试样中1%-0.001%微量成分，可测定的浓度下限为10-5到10-6mol/L

（化学分析可测定含量>1%的常量成分）准确度较高：相对误差2%-5%（精密仪器可达1%-2%）。

（化学分析可达0.1%-0.2%）测量范围宽:微量1%-10-3%;痕量10-4%-10-5%;常量1%-50%(示差分光光度法)应用广泛:几乎所有的无机离子有许多有机化合物；操作简便、快速、仪器价格适中、用途广。2024/4/21Analyticalchemistry10光谱分区能量小200nm400nm780nm大波长光谱区域紫外光区可见光区红外分析方法紫外分光光度法可见分光光度法50um红外分光光度法紫、蓝、青、绿、黄、橙、红2024/4/21Analyticalchemistry11物质对光的吸收1、物质对光选择性吸收的实质一束光通过某物质时，该物质的分子、原子或离子与光子发生碰撞，光子的能量转移至分子、原子或离子上，使这些粒子发生能级变化，由基态跃迁至较高能态，这个过程即为吸收。光是否被物质吸收，取决于光子的能量物质的结构只有当能级差△E与光子能量h

相当时物质吸收光。2024/4/21Analyticalchemistry122、物质的颜色与光吸收的关系复合光与单色光单色光：具有单一波长的光。复合光：由不同波长的单色光按一定比例组成的光如白光。2024/4/21Analyticalchemistry13溶液颜色与光吸收的关系溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入射光为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互补。互补色：组成白光的两种光。光的互补：蓝

黄2024/4/21Analyticalchemistry14互补色示意图

蓝450-480

紫400-450

红650-750青蓝480-490

青490-500

绿500-580

黄580-600

橙600-650白光KMnO4溶液吸收绿色的光，透过紫红的光，所以溶液呈现紫红色2024/4/21Analyticalchemistry152024/4/21Analyticalchemistry16溶液对光的作用示意图2024/4/21Analyticalchemistry17溶液颜色与吸收光颜色和波段的关系溶液的颜色

吸收光颜色波段（nm）黄绿黄橙红紫红紫蓝青蓝青紫蓝青蓝青绿黄绿黄橙红400~450450~480480~490490~500500~560560~580580~600600~650650~760KMnO4溶液吸收绿色的光，透过紫红的光，所以溶液呈现紫红色，λmax＝525nm2024/4/21Analyticalchemistry183、吸收曲线（吸收光谱）吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。吸收曲线的特点：不同的物质因其分子结构不同而具有不同的吸收曲线，定性分析的依据。同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和λmax的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。2024/4/21Analyticalchemistry19吸光度A吸收曲线图4005006000.1000.2000.3000.400吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。λ/nmA2024/4/21Analyticalchemistry20不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收曲线；2024/4/21Analyticalchemistry21300400500600λ/nmCr2O72-380nm525nmMnO4-高锰酸钾和重铬酸钾的吸收曲线A2024/4/21Analyticalchemistry222024/4/21Analyticalchemistry23KMnO4溶液λmax＝525nm同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和λmax的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。通常选最大吸收波长的单色光进行定量分析。2024/4/21Analyticalchemistry24比色分析法Colorimetric基本原理：在一定浓度范围内，溶液中有色物质的浓度与溶液颜色的深度成正比，根据溶液颜色深度，测定溶液中有色物质含量的方法。2024/4/21Analyticalchemistry25

1.朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c

二者的结合称为朗伯—比耳定律。二分光光度法基本原理(动画M1-2-4.swf)(动画M1-2-5.swf)2024/4/21Analyticalchemistry26朗伯—比耳定律

吸光度A：表征物质对光吸收程度的量。

A=lgI0/I=-lgT=bcA--吸光度

--摩尔吸光系数c--被测物浓度b--液层厚度（光程长度）T--透过率T=I/I0

I0--入射光强

I--透射光强摩尔吸光系数ε（L.mol-1.cm-1）

：在一定λ下，c=1mol/L，b=1cm时的吸光度2024/4/21Analyticalchemistry27例：用1,10-二氮菲光度法测定铁，已知Fe2+浓度为0.5mg/L，比色皿厚度2厘米，在

=508nm测得配合物吸光度A=0.19，求

。（1.1×104L.mol-1.cm-1

）A=lgI0/I=-lgT=bc朗伯—比耳定律的物理意义：当一束平行的单色光，通过稀的、均匀的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与吸光物质的浓度以及光径长度的乘积成正比。这是分光光度法定量测定的依据。课本p186习题4（2）、（5）2024/4/21Analyticalchemistry28朗伯—比耳定律适用条件：入射光为平行单色光，且垂直照射；吸光物质为均匀非散射体系；稀溶液，吸光质点之间无相互作用；辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象；吸光度具有加和性（A总=A1+A2+…）。2024/4/21Analyticalchemistry292、标准（工作）曲线

标准（工作）曲线绘制方法：在

、b固定的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，作A~c图，在相同条件下测定样品溶液的吸光度，从曲线上可查出被测样品的浓度。2024/4/21Analyticalchemistry30工作曲线图浓度（c）吸光度直线斜率为分光光度法灵敏度

越大，方法的灵敏度越高。2024/4/21Analyticalchemistry31浓度c正偏离负偏离吸光度工作偏离图依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线2024/4/21Analyticalchemistry32偏离原因：（1）与仪器有关的因素非单色光引起的偏离：L—B定律要求入射光为单色光，但目前仪器提供的入射光是由波长范围较窄的光带组成的复合光。非平行入射光引起的偏离（2）与测定样品溶液有关的因素介质不均匀引起的偏离化学因素引起的偏离：高浓度时引起溶液中吸光粒子之间相互作用上升，使吸光能力发生变化；化学反应引起的偏离。

2024/4/21Analyticalchemistry33３、分光光度法灵敏度分光光度法灵敏度

由实验测得。对于不同的吸光物质，同一波长下，越大，表示该吸光物质对于该波长的光吸收能力越大。用光度法测定该物质的灵敏度越高。摩尔吸光系数ε（L.mol-1.cm-1）

：在一定λ下，c=1mol/L，b=1cm时的吸光度ε>105：超高灵敏；ε=(6～10）×104

：高灵敏；ε<2×104

：不灵敏。ε仅与吸收物质本身的性质有关。可作为定性鉴定的参数。2024/4/21Analyticalchemistry34三、分光光度法的测量方法１、单一组分的测定（１）目视比色法标准系列法：用一套比色管，配制一系列不同含量的标准色阶，从管口垂直向下观察，比较待测试液与色阶中哪个溶液颜色相同，则认为两者浓度相同，从而确定待测试样的含量。（２）标准曲线法2024/4/21Analyticalchemistry35在一定条件下，工作曲线是一条直线，直线的斜率和截距可以用最小二乘法求得。工作曲线可以用一元线性方程表示：y=a+bx式中，x为标准溶液的浓度，y为相应的吸光度。使用最小二乘法确定的直线称为回归线，a、b称为回归系数。b是直线的斜率,a为直线的截距．可以用相关系数r来表示线性关系的好坏。相关系数越接近于1线性关系越好。一般的光度分析方法r>0.999。2024/4/21Analyticalchemistry36示例0.710mg/25mL

芦丁含量测定2024/4/21Analyticalchemistry37三、分光光度法的测量方法2、多组分的测定⑴各组分的吸收曲线互不重叠在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。⑵各组分的吸收曲线互有重叠，根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。Aλ1=εaλ1bCa

＋εbλ1bCb

Aλ2=εaλ2bCa

＋εbλ2bCb

2024/4/21Analyticalchemistry38三、分光光度法的测量方法3、双波长分光光度法多组分测定，吸收曲线绝大部分重叠或完全重叠，背景吸收较大或为浑浊样品时，用双波长分光光度计测定．采用双波长技术，作为参比的是试液本身对某一波长的吸光度，从分析波长信号减去来自参比的波长信号，消除组分干扰，进行准确测定．A=(1-2)bc2024/4/21Analyticalchemistry394、示差分光光度法（示差法）当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。示差法需要较大的入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则：Ax=εbcx

As=εbcs

A相对=ΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx

－cs

）=εbΔc示差法测得的吸光度A相对与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx

：

cx=cs+Δc2024/4/21Analyticalchemistry40四可见分光光度计光源吸收池检测器

单色器数据显示系统仪器结构框图2024/4/21Analyticalchemistry411、光源基本要求：在仪器工作的波长范围内，提供连续、有足够发射强度和良好稳定性的复合光，而且发射光的强度随波长的变化应尽可能小。光源：钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm紫外光源---氘灯可见光源---钨灯2024/4/21Analyticalchemistry422、单色器单色器作用：从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。单色器组成：由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等组成。单色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱镜和光栅），起分光的作用。玻璃棱镜——适用于可见光区石英棱镜——适用于紫外光区2024/4/21Analyticalchemistry43

吸收池用于盛放分析试样；

吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向；

吸收池要配对。因为吸收池材料本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。3、吸收池玻璃吸收池——仅适用于可见光区石英吸收池——适用于紫外和可见光区2024/4/21Analyticalchemistry44

检测器的功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化。

常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。

4、检测器氧化铯光电管——适用于可见光区(625-1000nm)锑铯光电管——适用于紫外光区(200-625nm)

信号显示器2024/4/21Analyticalchemistry45型号

价格（万元）波长nm分光器件数据处理指示产地7210.18360~800棱镜表头上海三分7220.28330~800光栅微机数显上海三分760CRT7.21190~900光栅PC打印扫描显象管上海三分751G0.91200~1000棱镜微机打印表头上海分析GDZ12.3200~800全息凹面光栅微机数显北京地质WFZ-122-10.7340~600光栅微机数显北京地质WFJ-80-10.3360~800棱镜PC打印扫描数显北京二分国产常用紫外可见分光光度计2024/4/21Analyticalchemistry46721型分光光度计2024/4/21Analyticalchemistry47722型分光光度计2024/4/21Analyticalchemistry482024/4/21Analyticalchemistry49类型：1．单波长单光束分光光度计：特点：使用时来回拉动吸收池→移动误差对光源要求高比色池配对721型分光光度计属此类型2024/4/21Analyticalchemistry50续前2．单波长双光束分光光度计：

特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差对光源要求不高可以自动扫描吸收光谱2024/4/21Analyticalchemistry51续前3．双波长双光束分光光度计特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差2024/4/21Analyticalchemistry522024/4/21Analyticalchemistry53分光光度计的使用

预热20min。调节T=0。调节T=100%（A=0）。测定样品的吸光度A。2024/4/21Analyticalchemistry54722N型分光光度计使用

(1)先预热仪器30分钟;(2)当参比在光路上时，按A/T/C/F键至显示为T,打开样品池盖,按0%键至000.0。关上盖，按100%键至显示为100.0。

(3)再重复一次。

(4)然后按A/T/C/F键至显示为Abs，放入待测样品比色皿，就可以读取吸光度了。2024/4/21Analyticalchemistry55分光光度计的保养与维护安置在干燥、无污染的地方；仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生；仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电源开关；比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干净，并用柔软清洁的纱布把水渍擦净；仪器经过搬动，请及时检查并纠正波长精度。2024/4/21Analyticalchemistry56１方法误差（１）显色反应的选择：显色反应的灵敏度＞104,对比度＞60nm（２）显色条件的选择：介质的酸度（３）显色体系对光吸收定律的偏离：使显色体系满足单色光、稀溶液、均匀介质。２仪器误差３操作者误差五分光光度法误差2024/4/21Analyticalchemistry57１仪器测量条件的选择２显色条件的控制３参比溶液的选择4

干扰及消除方法五提高分析结果准确度的方法

（分析条件的选择）2024/4/21Analyticalchemistry58

一般来说，当透射比为15%～65%（吸光度0.2～0.8）时，浓度测量的相对误差较小，这就是适宜的吸光度范围。１仪器测量条件的选择

可以通过调节待测溶液的浓度，选用适当厚度的吸收池等方式使吸光度落在此区间内。

通常选择最大吸收波长为入射光波长，以增大测量的灵敏度。2024/4/21Analyticalchemistry59

显色反应：用适当的试剂（显色剂）与待测离子反应生成对紫外或可见光有较大吸收的物质，然后再进行测定的反应。2显色条件的控制

显色反应具备的条件：1）显色的物质具有较大的摩尔吸光系数2)显色的物质要稳定、显色条件易于控制3）显色的物质与显色剂的最大吸收波长的差别在60nm以上

显色剂的用量和酸度条件要通过实验确定。

见课本p174图7-11和图7-122024/4/21Analyticalchemistry60

参比溶液（空白溶液）用于调节