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文档简介
甲型H1N1流感是一种急性呼吸道传染病,流感本身跟普通感冒都属于上呼吸道感染,二者的区别主要有两点:一是流感患者往往会出现全身难受的症状,包括四肢酸疼、腰背酸疼以及头疼等,这些症状会比普通感冒更重;二是一部分的流感病人还会出现胃肠道症状,比如呕吐、腹泻如何检测是否感染甲型流感病毒?已知其病原体甲型H1N1流感病毒是一种RNA病毒,其表面有一种特征性蛋白质A1、传统抗体制备方法及缺陷特异性差(能识别多种抗原),纯度低,灵敏度差抗原决定簇多种抗体不纯筛选单一B细胞不能无限增殖产生大量抗体
抗原
动物体内
抗体刺激浆细胞多克隆抗体抗原决定簇病原体、抗原、抗原决定簇、抗体、B淋巴细胞的对应关系?寿命有限①过程②缺陷一群识别不同抗原部位的抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验【一个大胆的猜想】1975年,米尔斯坦和柯勒1984年,诺贝尔生理学或医学奖既能产生特异性抗体,又能在正常培养条件下进行无限增殖能产生特异性抗体能无限增殖每一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体,必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖,即克隆。就称为单克隆抗体。由一个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的单一型抗体分子3.3通过细胞融合可产生具有新特性的细胞1.概念:2.范围:在一些融合因子的作用下,将两个或多个细胞合并形成一个细胞的技术。细胞融合技术①基因型相同的细胞间②基因型不同的同种生物细胞间3.诱导方式?③亲缘关系非常远的不同种生物细胞间资料1:1838年在肿瘤中观察到了细胞融合后的多核细胞,并在此后,相继于肺结核、天花脓包周围、水痘损害的皮肤、麻疹患者的扁桃体等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。1973年观察到天花病人血液中也有多核的血细胞存在肺结核病人病理切片1875年,科学家们首次观察到了脊椎动物(蛙)血液细胞的融合现象。1958年,日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。①物理法:电流刺激(电脉冲)、激光融合②化学法:聚乙二醇(PEG)③生物法:灭活的病毒(动物细胞融合特有)3.诱导方式一、两个或多个动物细胞经诱导可融合形成一个细胞灭活的病毒诱导机理什么是病毒的灭活?灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力,但是并不破坏病毒的抗原结构。灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面↓细胞膜被病毒颗粒穿通↓细胞膜连接↓细胞核融合,形成杂交细胞直流电脉冲诱导下极化,膜两侧产生电势,正负电荷相吸↓膜变薄,触发膜穿孔,细胞桥形成↓细胞质渗透、细胞核融合电脉冲诱导诱导机理4.诱导机理/原理:细胞膜出现一定程度损伤,细胞相互粘连而融合。细胞膜的流动性B淋巴细胞骨髓瘤细胞动物细胞融合单克隆抗体杂交瘤细胞能产生特异性抗体能无限增殖小组任务:结合书本尝试完善上图“抗甲流病毒单克隆抗体制备方案”①原理:一个(或一种)浆细胞只能产生一种抗体,小鼠的骨髓瘤细胞能够无限增殖,因此,杂交瘤细胞就具备了既能无限增殖,又能产生大量单一抗体的特征。其产生的单一抗体即为单克隆抗体1、单克隆抗体的制备二、细胞融合技术是制备单克隆抗体的基础给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞(免疫)骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞分离脾细胞诱导融合筛选B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤②制备过程1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验知识拓展:筛选获得杂交瘤细胞知识拓展:筛选获得杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基蝶呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径,没有S途径,但能不断分裂增殖。讨论:如何筛选出杂交瘤细胞并说明筛选机理?B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖,死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能增殖,死亡杂交瘤细胞能无限增殖,生长原理:HGPRT-细胞株培养基加氨基蝶呤(HAT培养基)给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞(免疫)骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞分泌所需抗体的杂交瘤细胞分离脾细胞第二次筛选HAT选择培养基克隆化培养,专一抗体检验诱导融合筛选Q1:此时筛选出来的杂交瘤细胞一定是我们需要的么?①基因相互抑制导致其无法产生抗体②遗传物质改变(基因突变、染色体变异)导致其无法产生抗体③多种抗体的杂交瘤细胞混合体系Q2:如何筛选?②制备过程抗体检测板多孔细胞培养板阳性孔抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法将杂交瘤细胞群稀释,约每孔1个细胞进行培养一段时间后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞知识拓展:筛选获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞克隆培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞(免疫)骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体分泌所需抗体的杂交瘤细胞分离脾细胞第二次筛选HAT选择培养基克隆化培养,专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖诱导融合筛选特异性强灵敏度高可大量制备②制备过程Q3:此过程涉及哪些动物细胞工程的技术?动物细胞融合技术、动物细胞培养2、细胞融合技术应用:①利用淋巴细胞和癌细胞的融合,培育__________②通过人-鼠杂交细胞丢失人的染色体可进行__________单克隆抗体基因定位经免疫的动物脾细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术获得产生相应抗体的B淋巴细胞第二次筛选:抗体阳性检测获得能产生所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选:利用选择培养基(HAT培养基)获得杂交瘤细胞克隆培养灭活仙台病毒B、BB、B瘤、瘤瘤、瘤腹腔腹水中提取活体体内培养思考:单克隆抗体制备过程中的几个问题(2)两次筛选的目的相同吗?(1)给小鼠注射抗原的目的是什么?(3)三次培养的目的是什么?(4)该过程运用了哪些技术?动物细胞培养技术、动物细胞融合技术。诱导小鼠体内发生特异性免疫应答,产生效应B细胞(浆细胞)第一次筛选:淘汰未融合或自融合的细胞,得到杂交瘤细胞。第二次筛选:淘汰不能产生所需抗体的细胞,最终获得能产生最佳特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞第一次是培养浆细胞、骨髓瘤细胞,并使两种细胞融合;第二次是培养杂交瘤细胞,筛选出能产生特异抗体的杂交瘤细胞。第三次是培养能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,便于提取大量单克隆抗体。动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞(免疫)骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选诱导融合选择培养基克隆化培养,专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖既能大量繁殖又能产生专一抗体在单克隆抗体制备过程中,两次筛选的目的和方法是不相同的。1、单克隆抗体的制备③优点a、特异性强:只能识别特异抗原分子的特定部位b、灵敏度高C、可大量制备d、纯度高2、单克隆抗体的应用a.作为诊断试剂——最广泛应用同位素标记的单克隆抗体,在特定组织中成像,定位诊断相关疾病。准确、高效、简易、快速原理:抗原-抗体杂交技术b.作为特异性的探针,研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及功能抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体艾滋病检测试剂c.用于治疗疾病和运载药物
①特异性强、灵敏度高
生物导弹——单克隆抗体+抗癌药物
②疗效高、毒副作用小
2、单克隆抗体的应用抗癌药物应用时最大的问题?“生物导弹”追踪癌细胞植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法;聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能2.下图为科研工作者利用小鼠制备H7N9禽流感病毒单克隆抗体的过程,请据图回答有关问题。(1)图中将H7N9病毒抗原基因导入受体细胞常用的方法是
。
(2)在受体细胞的培养过程中,为了防止污染,通常还要在细胞培养液中添加一定量的
,其培养液与植物组织培养的培养基相比,特有的天然成分是
。
(3)图中X细胞一般选用
,与植物体细胞杂交相比,诱导X细胞和Y细胞融合还可采用
。
显微注射技术抗生素动物血清骨髓瘤细胞
灭活的病毒
(4)单克隆抗体的制备过程需要经过多次筛选,首先用特定的选择性培养基筛选出
,最终获得足够数量
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