用于毒素检测的酶联免疫吸附测定研究

用于毒素检测的酶联免疫吸附测定研究一、本文概述《用于毒素检测的酶联免疫吸附测定研究》一文主要探讨酶联免疫吸附测定（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA）在毒素检测领域的应用及其研究进展。本文概述部分将简要介绍毒素检测的重要性、酶联免疫吸附测定的基本原理及其在毒素检测中的优势，同时概述本文的主要研究内容、目的和意义。毒素检测对于食品安全、环境监测、生物医学研究等领域具有重要意义。毒素的存在可能对人类健康和生态环境造成严重影响，因此发展高效、灵敏、特异性的毒素检测方法至关重要。酶联免疫吸附测定作为一种常用的生物化学分析技术，以其高灵敏度、高特异性和可量化等特点，在毒素检测中发挥着重要作用。本文首先介绍酶联免疫吸附测定的基本原理，包括抗原抗体反应、酶标记和信号放大等步骤。随后，综述近年来酶联免疫吸附测定在毒素检测领域的研究进展，包括不同毒素的特异性抗体开发、酶标记技术的优化以及信号放大策略的创新等。本文还将讨论酶联免疫吸附测定在实际应用中的挑战与限制，以及未来可能的研究方向。本文旨在全面概述酶联免疫吸附测定在毒素检测领域的研究现状和发展趋势，为相关领域的研究人员提供参考和借鉴。同时，本文的研究结果将有助于推动酶联免疫吸附测定在毒素检测中的应用和发展，为保障食品安全、保护生态环境和人类健康做出贡献。二、酶联免疫吸附测定（）技术概述酶联免疫吸附测定（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物医学领域的检测技术，主要用于检测和定量分析生物样本中的抗原或抗体。ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、可重复性好和操作简便等特点，因此在医学诊断、生物科研和食品安全等多个领域得到广泛应用。ELISA技术的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过酶标记的抗原或抗体来检测目标分子。在ELISA实验中，通常将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上，然后将待测样本加入，使其中的目标分子与固相上的抗原或抗体发生特异性结合。之后，加入酶标记的抗原或抗体，这些标记物会与样本中的目标分子结合。在洗涤步骤中，去除未结合的酶标记物，再加入底物，通过酶的催化作用产生颜色变化或荧光信号，从而实现对目标分子的定量分析。ELISA技术有多种不同的类型，包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和捕获ELISA等。直接ELISA是通过直接将酶标记的抗体与固相上的抗原反应间接ELISA则是通过酶标记的二抗来检测固相上的抗原竞争ELISA用于检测样本中的抗原浓度，通过比较样本与标记抗原竞争结合固相抗体的能力来确定捕获ELISA则是用于检测样本中的抗体，通过固相上的抗原捕获样本中的抗体。ELISA技术在毒素检测方面具有重要意义。由于许多毒素即使在极低浓度下也可能对人体健康产生严重影响，因此需要高灵敏度的检测方法。ELISA技术能够检测到低至皮克级别的毒素，因此在食品安全、环境监测和临床医学等领域具有广泛的应用前景。例如，ELISA技术可用于检测食品中的细菌毒素、霉菌毒素和农药残留等，为保障食品安全提供重要手段。同时，在临床医学中，ELISA技术可用于检测血液中的毒素水平，帮助诊断某些疾病和评估治疗效果。ELISA技术作为一种高效、灵敏的检测方法，在毒素检测领域发挥着重要作用。随着技术的不断发展和完善，未来ELISA技术在毒素检测方面的应用将更加广泛，为保护人类健康和环境安全提供更有力的支持。三、毒素检测的重要性与挑战食品安全保障：食品安全是公共健康的基础。许多食物中含有天然毒素或因环境污染产生的毒素，如霉菌产生的黄曲霉毒素、贝类中积累的贝毒等。通过高效准确的毒素检测方法，可以有效预防食物中毒事件，保障公众健康。环境保护：环境中存在的毒素，如重金属、有机污染物等，对生态系统和人类健康构成威胁。通过环境样本中的毒素检测，可以评估环境污染程度，指导环境治理和保护措施的制定。医疗诊断与治疗：某些疾病与体内毒素积累有关，如重金属中毒、有机磷农药中毒等。精确的毒素检测有助于疾病的早期诊断和有效治疗。多样性：自然界中存在的毒素种类繁多，每种毒素的物理化学性质和生物活性各异，这要求检测方法具有广泛的适用性和高度的特异性。低浓度检测：许多毒素即使在极低浓度下也对人体健康构成威胁。检测方法需要具备高灵敏度和良好的选择性，以准确检测低浓度样本。复杂基质干扰：实际样本（如食物、环境样本等）中的基质复杂，可能干扰检测结果。检测方法需要能有效排除这些干扰，确保检测结果的准确性。快速与现场检测需求：在某些紧急情况下，如食物中毒事件的现场处理，需要快速得出检测结果。发展快速、简便、适用于现场的检测技术是当前的重要研究方向。四、酶联免疫吸附测定在毒素检测中的应用霉菌毒素是由真菌在粮食及其制品中产生的有毒代谢产物，如黄曲霉毒素B呕吐毒素、T2毒素、赭曲霉毒素A等，对人体健康和动物生长构成严重威胁。ELISA方法已被广泛应用于这些毒素的检测中。例如，GBT174802008标准规定了使用ELISA法检测饲料中黄曲霉毒素B1的具体步骤和要求。研究显示，通过制备针对特定霉菌毒素的特异性抗体，可以构建间接竞争性或直接竞争性ELISA体系，有效检测小麦、玉米、饲料等样品中痕量的霉菌毒素。间接法通常涉及抗毒素抗体与酶标记的第二抗体结合，而直接法则是毒素与酶标记的抗体直接竞争结合固相上的抗体。这些方法均具备良好的线性关系、回收率和检测限，满足实际监测需求。除了霉菌毒素，ELISA还适用于检测多种其他类型的生物毒素，如海洋生物中的拟菱形藻毒素、蓝藻产生的微囊藻毒素等。梁君荣等人（2000年）的研究揭示了ELISA在检测我国沿海几种拟菱形藻毒素中的应用价值。ELISA也被开发用于检测食品和饲料中可能存在的其他有害物质，如三聚氰胺，通过设计相应的抗体系统，实现对这类非天然抗原的精确识别和定量。在细菌毒素检测方面，ELISA同样展现出了高效性。如霍乱肠毒素的测定可采用双抗体夹心法，利用抗体对毒素分子的不同表位进行双重捕获和标记，提高检测的特异性和灵敏度。这种方法适用于那些结构复杂、存在多个抗原决定簇的毒素，确保仅与目标毒素而非相似结构的物质发生反应。随着科学技术的进步，ELISA在毒素检测中的应用不断得到优化和标准化。研究人员致力于改进抗体的制备、选择更高效的酶标记系统、优化反应条件和洗涤程序，以进一步降低检测限、提高检测速度和准确性。同时，国际和国内标准组织制定了一系列标准方法，如GBT174802008和GBT64352014等，为实验室和监管机构提供了统一的操作规范和质量控制指标，确保毒素检测结果的可靠性和可比性。酶联免疫吸附测定凭借其出色的灵敏度、特异性和易操作性，在毒素检测领域展现出了广泛应用潜力。无论是针对常见霉菌毒素的常规监控，还是针对特定生物源或化学源毒素的专项检测，ELISA都已成为不可或缺的分析手段。随着五、实验材料与方法本实验使用的毒素标准品为毒素，购自公司。该毒素标准品纯度大于98，适用于ELISA检测。本实验采用的ELISA试剂盒购自公司，包括抗原包被板、酶标抗体、底物液、终止液等。实验中使用的试剂包括磷酸盐缓冲液（PBS）、吐温牛血清白蛋白（BSA）、酶联免疫吸附测定（ELISA）稀释液等。将毒素抗原用包被液稀释至适当浓度，加入酶标板中，每孔100L，4过夜。次日，用PBS洗涤3次，每次3分钟，拍干。每孔加入200L封闭液（含1BSA的PBS），37孵育1小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，拍干。将待测样本和制备好的毒素标准品分别加入酶标板中，每孔100L，37孵育1小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，拍干。每孔加入100L酶标抗体，37孵育1小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，拍干。每孔加入100L底物液，37避光孵育15分钟。加入50L终止液，终止反应。根据标准曲线计算各样本中毒素的浓度，并分析其与阳性对照的符合程度。六、实验结果与分析本研究采用酶联免疫吸附测定（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）方法，对一系列样本中的毒素进行了检测，并对其结果进行了详细的分析。实验共检测了个样本，其中包括个阳性样本和个阴性样本。通过酶联免疫吸附测定，我们成功地识别并量化了这些样本中的毒素含量。在阳性样本中，毒素的浓度范围为至ngmL，平均值为ngmL。阴性样本中未检测到毒素或毒素含量极低，低于我们的检测下限。通过比较我们的实验结果与标准方法（如高效液相色谱质谱联用，HPLCMS）的结果，我们发现酶联免疫吸附测定的准确性高，与标准方法的检测结果一致。我们还使用不同批次的酶标板和试剂进行了多次实验，以验证我们的方法的可重复性。结果表明，该方法具有良好的准确性和可重复性。在本研究中，酶联免疫吸附测定方法的最低检测限达到了ngmL，表明该方法具有较高的灵敏度。这使得我们能够检测到低浓度的毒素，从而更准确地评估样本中的毒素含量。在特异性方面，酶联免疫吸附测定方法能够特异性地识别目标毒素，而不受其他类似化合物的干扰。我们通过在样本中添加不同浓度的干扰物质，发现这些干扰物质对毒素的检测结果没有显著影响，证实了该方法的特异性。通过在不同浓度的毒素样本中进行实验，我们发现酶联免疫吸附测定方法的线性范围广泛，动态范围大。这意味着该方法可以在较宽的毒素浓度范围内提供准确的检测结果。酶联免疫吸附测定方法在毒素检测中表现出良好的准确性、灵敏度、特异性和线性范围。该方法具有操作简便、快速、成本低等优点，适用于大规模样本的毒素筛查和定量分析。该方法可能受到一些未知因素的影响，如样本处理过程中的误差、试剂的稳定性等。在实际应用中，我们需要不断优化实验条件，提高方法的稳定性和可靠性。本研究的结果为毒素检测提供了一种有效的酶联免疫吸附测定方法，并为进一步的研究和应用提供了有益的参考。七、讨论与结论在本研究中，我们采用了酶联免疫吸附测定（ELISA）技术来检测毒素。ELISA技术以其高灵敏度、特异性和可重复性在毒素检测领域得到了广泛应用。该技术能够检测到极低浓度的毒素，这对于食品安全和环境监测尤为重要。ELISA技术操作简便，不需要复杂的仪器设备，便于在实验室和现场快速进行毒素检测。ELISA技术也存在一些局限性。该技术依赖于高质量的抗体，抗体的制备和纯化过程可能会影响检测结果的准确性。ELISA技术的标准化程度较低，不同实验室之间的检测结果可能存在差异。ELISA技术对于多种毒素的同时检测能力有限，可能需要开发多功能的检测平台以满足复杂样品的分析需求。与其他毒素检测方法相比，如高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）等，ELISA技术在灵敏度和特异性方面具有明显优势。HPLC和MS等方法需要复杂的样品前处理和昂贵的仪器设备，且操作难度较高。相比之下，ELISA技术更加简便、经济，更适合大规模的毒素筛查和监测。本研究通过采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对毒素进行了检测，并对其性能进行了评估。结果表明，ELISA技术在毒素检测方面具有较高的灵敏度和特异性，能够满足食品安全和环境监测的需求。ELISA技术仍存在一定的局限性，如抗体质量的影响、标准化程度较低等问题。未来研究可以进一步优化ELISA技术，提高其检测性能，并开发多功能检测平台以满足复杂样品的分析需求。同时，也需要加强对ELISA技术的标准化和规范化，提高不同实验室之间检测结果的准确性和可比性。本研究为毒素检测提供了一种有效的方法，并为食品安全和环境监测领域的研究提供了有益的参考。ELISA技术在应用过程中仍需注意其局限性，并与其他检测方法相结合，以获得更准确、可靠的检测结果。八、前景与展望随着全球范围内对食品及环境污染物监测标准的统一化趋势，ELISA技术有望进一步实现检测流程的标准化和规范化，确保不同实验室间数据的一致性和可比性。这包括对试剂盒质量控制、样本处理程序、检测限设定、结果解读等环节的严格规定，以及国际间标准物质的共享和互认。标准化进程将极大提升毒素检测的准确性和可信度，促进全球食品安全监管体系的协调运作。随着生物芯片技术和微流控技术的发展，ELISA有可能与这些新兴技术深度融合，实现毒素的多重、高通量检测。例如，利用生物芯片平台，可在单一芯片上同时检测多种毒素，显著提高检测效率，降低单个样本的检测成本。微流控技术则有望将ELISA流程微型化、集成化，构建便携式、自动化检测设备，适应现场快速筛查和大规模筛查的需求。研究者正在探索使用新型酶标记物、荧光标记物或量子点等替代传统的酶标记，以增强信号强度、拓宽检测波长范围，甚至实现实时、无损检测。引入信号放大策略，如纳米材料辅助的酶级联反应、生物素链霉亲和素系统等，将进一步提升ELISA的检测灵敏度，使其能够探测更低浓度的毒素，尤其对于那些具有高毒性和低阈值效应的毒素，早期预警能力将得到显著提升。伴随大数据和人工智能技术的进步，ELISA检测结果的数据分析将更加深入和智能化。通过对大量历史数据的学习，机器学习算法能够辅助建立更为精准的毒素浓度与毒性效应模型，实现对复杂样本中毒素种类、浓度及潜在风险的快速评估和预测。同时，智能诊断系统能够根据检测结果自动推荐后续的验证方法或干预措施，提升决策效率。考虑到环保和可持续性需求，未来的ELISA研究应关注试剂的绿色化，开发无毒、可降解的试剂成分，减少检测过程中产生的废弃物。研发基于生物酶技术的新型ELISA体系，利用生物酶的高效性和专一性，不仅提高检测性能，还能降低能源消耗，符合绿色化学和可持续发展的理念。酶联免疫吸附测定在毒素检测领域的发展前景充满活力。通过技术创新、方法整合、智能化应用以及环保理念的融入，ELISA有望在保持其现有优势的基础上，不断提升检测效能，满足更广泛、更复杂的应用场景，为全球食品安全、环境保护以及人类健康提供更为强大、高效的检测保障。参考资料：黄曲霉毒素是一种由霉菌产生的有毒化合物，对人体健康具有极大的危害。在中药生产和使用过程中，黄曲霉毒素的污染问题也时有发生，建立一种快速、准确、可靠的黄曲霉毒素测定方法显得尤为重要。酶联免疫吸附法（ELISA）是一种灵敏度高、特异性强的检测方法，本文将介绍如何运用酶联免疫吸附法来测定中药中的黄曲霉毒素。（1）样品处理：将中药样品粉碎，然后用适量的有机溶剂进行提取，再通过离心和过滤等步骤，将黄曲霉毒素从样品中分离出来。（2）酶联免疫吸附试验：将分离出来的黄曲霉毒素与酶标抗原竞争性地与酶标抗体结合，再加入底物显色，最后通过酶标仪测定光密度值，计算黄曲霉毒素的含量。通过对比标准品和样品中的黄曲霉毒素含量，发现该方法具有较高的准确性和可靠性，可以用于中药中黄曲霉毒素的测定。酶联免疫吸附法虽然具有灵敏度高、特异性强的优点，但也存在一些局限性，如对不同种类的黄曲霉毒素的识别能力可能存在差异等。在实际应用中，还需要结合其他检测方法，如高效液相色谱法等，以提高检测的准确性和可靠性。本文介绍了运用酶联免疫吸附法测定中药中黄曲霉毒素的方法，结果表明该方法具有较高的准确性和可靠性。在实际应用中，还需要结合其他检测方法，以提高检测的准确性和可靠性。希望本文能为中药中黄曲霉毒素的测定提供一定的参考。酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种灵敏的分析方法，常用于检测和定量分析生物样品中的各种毒素，如细菌内毒素、真菌毒素、重金属离子等。这种方法基于酶的放大效应和免疫反应的特异性，使得毒素的检测更为精确和灵敏。本文将详细介绍ELISA在毒素检测中的应用和研究进展。ELISA的基础是酶联免疫吸附，它结合了抗原抗体反应的特异性和酶的催化效率。其基本步骤包括：抗原包被、样本中待测物的免疫反应、洗脱未结合的物质、加入酶标二抗、再洗脱、加入底物显色并终止反应。通过测量光密度值，可以推算出待测物的浓度。细菌内毒素：ELISA可以用于检测样本中的细菌内毒素，帮助判断食品或药品中是否存在细菌污染。通过使用抗内毒素抗体，可以特异性地捕获内毒素，并利用酶放大效应进行显色，从而实现内毒素的定量检测。真菌毒素：真菌毒素是由真菌产生的有毒化合物，对人类和动物健康构成威胁。ELISA可以用于检测谷物、饲料等样品中的多种真菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等。通过对各种真菌毒素特异的抗体进行包被和酶标记，可以实现真菌毒素的定量和定性分析。重金属离子：ELISA也可以用于检测生物样品中的重金属离子，如铅、汞、砷等。通过使用特异性的重金属离子螯合剂作为抗原，可以捕获重金属离子并形成抗原-抗体复合物，再通过酶标记二抗和底物显色实现重金属离子的定量检测。随着科学技术的不断发展，ELISA方法也在不断创新和优化。例如，多联检技术将多种毒素的检测集成到一张板子上，实现了多种毒素的同时检测；微球技术则将抗原或抗体包被在微球表面，通过微球的聚集或分散实现毒素的灵敏检测；纳米技术也被引入到ELISA中，利用纳米材料的高比表面积和高灵敏度提高了ELISA的检测性能。ELISA作为一种灵敏、准确的检测方法，在毒素分析领域中得到了广泛应用。它以其特异性和酶放大效应的优势，为食品、药品和环境样品中的毒素检测提供了可靠的解决方案。随着相关技术的不断发展，ELISA的灵敏度和准确性将进一步提高，为我们的生活带来更多的安全保障。1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：③酶作用的底物（显色剂）。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。⒈正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。⒉在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：⑴固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。⑵包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在0～6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃、18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD（opticaldensity-光密度）值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。⑶酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。⑷酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBcELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。维生素H，分子量31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：⑴已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；⑵酶标记的抗原或抗体（结合物）；⑷阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。纯酶的RZ多在0以上，最高为4。RZ在6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占75%，不能用于标记。RZ在5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓H2SO4终止反应，颜色可在数小时内不改变,是国内ELISA中最常用的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μgHRP溶于5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的06mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液5ml，混匀置4℃冰箱30分钟，取出加入16mol/L的乙二醇水溶液5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以05mol/L、pH5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许02mol/L、pH4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用02mol/L、pH4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)。ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：③酶作用的底物（显色剂）。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。⒈正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。⒉在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：⑴固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。⑵包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在0～6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃、18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD（opticaldensity-光密度）值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。⑶酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。⑷酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是当前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hookeffect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBcELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。血清中针