大规模细胞培养及发酵技术专家讲座

大规模细胞培养和微生物发酵技术

大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第1页细胞培养概述动物细胞特点：无细胞壁倍增时间长，生长迟缓需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第2页动物细胞培养概述动物细胞培养定义：动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内生理环境，在无菌、适温和丰富营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功效一门技术大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第3页动物细胞培养概述生长特征贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第4页体外培养细胞基本技术体外培养特点体外培养工具体外培养条件体外细胞生长增殖过程培养方法大规模培养技术大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第5页体外培养特点营养条件苛刻适应性差，敏感培养时间长，易污染大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第6页体外培养条件温度，37℃pH：7.2-7.4气体：氧，二氧化碳，氮气营养条件：需要各种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中各种成份可由血清提供大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第7页细胞大规模培养技术

大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第8页细胞大规模培养方法反应器贴壁培养轻易换液，不需特殊分离细胞和培养液设备，可采取灌流培养取得高密度，但扩大规模较难，适合制备量小，价值高生物药品。（CelliGenPlusTM）微载体培养最有前途动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴壁培养优点，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline）无血清悬浮培养用已知人源或动物起源蛋白或激素代替动物血清一个细胞培养技术大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第9页动物细胞大规模培养过程中主要参数pH溶氧温度谷氨酸/谷氨酰胺葡萄糖乳酸CO2大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第10页动物细胞大规模培养过程中主要参数NH4+K+/Na+Ca++渗透压细胞密度大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第11页动物细胞大规模培养存在问题细胞凋亡细胞在高密度条件下，因为细胞多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞生长和表示均受到严重影响大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第12页动物细胞大规模培养存在问题细胞凋亡主要是细胞生长条件较恶劣，包含：1.营养缺乏2.有害代谢产物积累3.pH和溶氧控制不妥4.机械搅拌剪切力较大5.渗透压大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第13页细胞大规模培养应用生产疫苗蛋白质和多肽药品基因治疗单抗大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第14页微生物培养技术概述传统：酿酒、抗生素、制醋基因工程：生产蛋白质药品、疫苗等（大肠杆菌、酵母）普通采取高密度发酵技术大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第15页微生物培养培养过程决定于：菌种培养条件大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第16页

微生物培养过程主要参数：温度pH溶氧葡萄糖/甘油乙酸大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第17页

乳酸NH4+磷酸盐乙醇(酵母)甲醇(酵母)细胞密度大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第18页微生物高密度培养发酵培养基表示基因调控宿主菌质粒拷贝数及稳定性大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第19页

高密度培养关键是发酵补料控制,依据重组菌生长特点及产物表示方式采取合理营养物质流加方式恒速流加变速流加指数流加大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第20页

微生物高密度培养乙酸形成:培养液中葡萄糖含量超出菌体生长所需量或在缺氧情况下,便会大量产生乙酸.降低乙酸策略:限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培养温度大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第21页

宿主菌降低比生长速率透析培养大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第22页细胞培养和微生物发酵中主要参数了解生物技术应用GlucoseGlutamineAmmoniaLactate大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第23页pH不一样细胞含有不一样最正确pH范围pH能影响葡萄糖和谷氨酰胺代谢，在低pH条件下，葡萄糖消耗速度慢

pH能影响细胞生长和目标产物量

大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第24页CO2在细胞培养过程中，CO2

与碳酸氢盐形成缓冲对，稳定培养液中pHCO2也可用于计算呼吸商，反应细胞活力和代谢旺盛程度细胞代谢（呼吸作用）会产生CO2(废物)CO2

水平增加会抑制细胞生长和细胞活性，从而影响目标蛋白表示，当溶液中CO2到达14-15%时，会严重抑制细胞生长CO2+H2O<<>>H2CO3<<>>H++HCO3-大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第25页DO(溶氧）葡萄糖等需氧来氧化产生ATP供细胞能量用于测量和跟踪细胞消耗氧速率.

大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第26页溶氧在细胞培养和发酵过程中，O2通常是限制营养成份，是因为它在溶液中低溶解度:通常关心对培养液中%O2,也就是“溶氧”值(DO):理论DO:80%+/-5%(哺乳动物细胞培养)>90%DO2(细菌培养）O2也可能经过自由基形成对细胞造成伤害,在低pO2

水平，细胞活性通常越高

(O2值必须维持在最低水平)然而,原代细胞可能在低O2

条件下繁殖受延迟

因而，维持正确O2平衡，对确保全部细胞正确生长都非常主要,普通30-50%大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第27页葡萄糖葡萄糖两个主要功效:细胞主要能量物质主要细胞碳源

葡萄糖和谷氨酰胺是相互补充:产生其它代谢物(比如:天冬氨酸)提供能量在全部细胞中经过糖酵解路径转变成丙酮.

葡萄糖代谢随细胞生长而增加.葡萄糖通常是细胞生长限制原因大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第28页葡萄糖监控细胞反应器和发酵罐中葡萄糖水平:确保细胞正常生长所需能量.开发延长细胞培养周期标准补料策略.计算葡萄糖消耗速率和决定批次培养最正确起始浓度.大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第29页乳酸=氧化问题在培养过程中，大多数乳酸来自于葡萄糖代谢，但也有一部分来自于谷氨酰胺代谢.基于高细胞密度和深液位，氧消耗非常大.经典范围(组织培养):0-5g/LO2

消耗造成乳酸形成，最终造成pH下降.对恒定pH:抑制细胞生长乳酸水平在低到4mM到高达70mM(取决于细胞).在大多数情况下，铵对细胞生长抑制比乳酸更严重.大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第30页乳酸监控长时间细胞培养中乳酸积累.计算乳酸产量与葡萄糖消耗之间代谢关系考查乳酸盐对细胞表示产物毒害影响大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第31页铵细胞培养和发酵中铵起源:主要起源:代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸其它氨基酸脱氨基作用

铵水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式.引发细胞抑制铵离子浓度范围:从: 0.5mM(LMouseCells)到: 40.0mM(M.AscitesTumorCells)

(不一样细胞株对铵有不一样耐受度)大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第32页铵pH会受NH3增加影响:

NH4+<<>>NH3+H+

铵增加也会改变细胞内蛋白质运动.监控发酵罐和生物反应器中铵水平（废物）.

推算谷胺酰胺降解水平.

考查铵浓度对细胞密度和产物浓度影响.监控引入培养基质量.大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第33页限制铵抑制策略增加换液速率(补料).维持培养液中低谷氨酰铵浓度降低其转化和降解.在低pH培养降低NH3形成.

去除培养液中铵:酶转化经过特殊

“PTFE”

膜将NH3扩散到低pH溶液中使用能够逐步接收高NH3

浓度细胞大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第34页谷氨酰胺与葡萄糖一样,谷氨酰胺也是细胞主要物质:

*碳和氮 *能量谷氨酰胺通常被认为是细胞培养主要限制营养谷氨酰胺是生物合成前体物质:

*嘌呤 *嘌呤核苷谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬主要氨基受体大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第35页谷氨酰胺监控谷氨酰胺水平:确保细胞生长所需能量.

开发长时间细胞培养标准化补料策略.

计算谷氨酰胺消耗速率和决定批次培养最正确其始浓度.大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第36页谷氨酸需用来计算谷氨酰胺需确证谷氨酸浓度，确保没加进谷氨酰胺结果.谷氨酰胺降解产物大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第37页Na/KNa-K:对适当培养基生产很主要.维持溶液/培养基适当离子强度.大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第38页渗透压渗透压是溶液浓度一个反应:测定渗透压参考方法是使用渗透压计经典细胞培养液渗透压值:

300+/-30mOsmol/kg.渗透压升高50-100mOsmol/kg会显著影响一些细胞生长.一些溶液/化合物可作为渗透压保护剂(维持渗透压稳定和更低).这些物质:

甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸大规模细胞培养及发酵技术专家讲座第39页