营养和培养基专家讲座

第四节培养基FoodsofMicroorganisms1887兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第1页培养基概念人工配制、适合于不一样微生物生长繁殖或产生代谢产物混合营养基质。培养基条件任何培养基都应该具备微生物生长所需六大营养要素适当营养素种类适当营养素百分比培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作基础。碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第2页培养基中应含满足微生物生长发育：水分、碳源、氮源、生长因子以及基本离子，磷、硫、钠、钙、镁、钾和铁及各种微量元素。另外，培养基还应含有适宜酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定氧化还原电位和适当渗透压。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第3页一、选取和设计培养基标准和方法（一）选取和设计培养基标准1、目标明确2、营养协调3、理化条件适宜4、经济节约在微生物学研究和生产实践中，配制适当培养基是一项最基本要求。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第4页1、目标明确培养对象及产物培养目标不一样，原料选择和配比不一样。培养不一样微生物应依据其特点采取不一样培养条件。营养类型及种类不一样微生物需要不一样培养基。自养型微生物培养基：不能含有机物，由简单无机物组成。异养型微生物需要在培养基中添加有机物，如异养型细菌惯用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。光能营养型需要提供光照。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第5页细菌、放线菌、酵母菌和霉菌营养要求现有共性也有特征，应选取不一样培养基。放线菌：麦芽汁培养基；酵母菌：高氏培养基；霉菌：察氏培养基或豆芽汁等培养基。主要几类微生物所需培养基各不相同。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第6页2、营养协调微生物细胞组成元素调查分析，是培养基设计主要参考依据。培养基中营养物质浓度适当时，微生物才能生长良好。浓度过低，不能满足需要；浓度过高，对其生长有抑制作用，如高渗溶液抑菌作用。营养物质之间浓度配比，直接影响微生物生长繁殖或代谢产物积累。不一样营养物质之间百分比：大致十倍递减。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第7页营养协调标准中需要注意几点其中碳氮比（C/N）影响较大。碳氮比（C/NRatio）指在微生物培养基中所含碳源中碳原子摩尔数与氮源中氮原子摩尔数之比指培养基中碳源物质与氮源物质质量比值，也指培养基中还原糖含量与粗蛋白含量比值兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第8页碳氮比主要性碳源不足，菌体易早衰；氮源过量，菌体生长过旺，代谢产物积累少；氮源不足，菌体生长过慢。真菌：高C/N比细菌：低C/N比我们能够经过控制培养基碳氮比，来调控菌体生长或代谢产物积累。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第9页培养基中各矿质元素间百分比要适当，预防单盐毒害作用。某种氨基酸过多，发生氨基酸不平衡，将会影响对其它氨基酸吸收。微量元素除尤其需要外，普通不另外供给。因为培养基中所加牛肉膏、蛋白胨、糖及其它无机盐中均含有一定量微量元素。用自来水配制培养基时，微量元素更不成问题。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第10页3、理化条件适宜培养基理化条件pH水分活度（Aw）和渗透压氧化还原电位（Eh）兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第11页(1)pH各类微生物生长繁殖或产生代谢产物最适pH条件各不相同，各大类微生物都有适当生长pH范围。通常培养条件细菌和放线菌：pH7.0～7.5酵母菌和霉菌：pH4.5～6.0范围内生长兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第12页在微生物生长繁殖和代谢过程中，常因营养物质消耗和代谢产物积累，引发pH改变，造成微生物生长迟缓、代谢产物产量下降。

为防止此现象，维持培养基pH相对恒定，通常加入pH缓冲剂，进行调整。pH内源调整磷酸盐缓冲液（KH2PO4、K2HPO4）不溶性碳酸盐CaCO3或碳酸氢钠pH外源调整指在培养过程中不停或间断向液体培养基中流加酸液或碱液调整方法。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第13页(2)水分活度（Aw）和渗透压微生物在等渗环境中良好生长

高渗环境生长受抑：质壁分离

低渗环境脆弱菌体易破裂死亡：吸水膨胀微生物有一定适应渗透压改变能力

细胞内渗透压调整机制渗透压大小由溶液中所含分子或离子质点数决定几个数据

G+细菌：20atm

G-细菌：5～10atm兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第14页兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第15页水分活度水分活度Aw

相同温度和压力下，体系中溶液水蒸汽压与纯水蒸汽压之比。亦等于该溶液百分相对湿度。表示微生物可实际利用游离水含量Aw=p/p0微生物生长最低Aw普通细菌：0.91（嗜盐细菌0.75,葡萄球菌0.85）普通酵母：0.88（耐高渗酵母：0.60）普通霉菌：0.80（干性霉菌：0.65）兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第16页常见食品水分活度物品名称Aw纯水1.000人血0.995新鲜水果0.97～0.98海水0.98家畜鲜肉0.97面包0.95糖酱、火腿0.90物品名称Aw香肠0.85果酱0.80饱和蔗糖液0.76咸鱼0.75糖果、干果0.70谷物、面粉0.65奶粉0.20兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第17页度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接收电子趋势一个指标。（3）氧化还原电位（Eh）普通好氧菌：0.1伏以上可生长，0.3-0.4伏适宜兼性厌氧菌：0.1伏以上有氧呼吸；0.1伏以下进行发酵厌氧菌：低于0.1伏条件下生长不一样类型微生物生长对氧化还原电位要求不一样。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第18页影响Eh原因与氧分压相关受pH影响。pH↓或[O2]↑，Eh↑

增加通气量（如振荡培养、搅拌）提升培养基氧分压，或加入氧化剂，可增加Eh；煮沸驱氧后将培养基与空气隔绝，以及在培养基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢（0.025%）、半胱氨酸（<0.05%）、铁屑等可降低Eh。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第19页4、经济节约配制培养基时应尽可能选取廉价且易取得原料做培养基成份。尤其是在发酵工业中，以降低生产成本。以粗代精：糖蜜V蔗糖以野代家：粗木薯粉V优质淀粉以废代好

黄豆浆水

造纸厂亚硫酸废液（含戊糖）以简代繁以无机氮代蛋白以纤代糖以烃代粮以国代进兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第20页选取粗原料--对微生物而言，纯度较高精原料(如蔗糖)其营养成份倒不如纯度低粗原料(如红糖)完全。粗原料中所谓“杂质”能提供微生物各种营养要素，且价格较低。设计培养基时应尽可能利用粗原料。

----选取工农业副产品--微生物发酵所需标准原料(如碳源中糖、淀粉及氮源中蛋白胨等)价格昂贵，农副产品及其它工业下脚料等价格低廉。故在碳源选择上，应选取富含淀粉薯类、废糖蜜、麸皮、酒糟、酱渣及纸厂含有戊糖等成份亚硫酸废液等代替纯淀粉和糖类；在氮源上，用棉子饼粉、蚕蛹粉、豆饼粉及花生饼粉等副产物代替黄豆粉等蛋白质原料。

----选取无机氮源--“无机氮”指硝酸盐、铵盐和尿素等。在培养基中用无机氮作氮源，让微行物将其转化为氨基酸、蛋白质等含氮有机物，生产菌体蛋白。微生物蛋白生产效率远高于植物和动物蛋白，可补充当前人类食物及动物饲料中蛋白质严重不足。

----选取低浓度培养基--普通认为培养基中营养物质种类愈多、含量愈高其营养愈丰富，发酵效果愈好。但营养物质过多，会造成溶氧量下降，渗透压增大等副效应，对微生物生长不利。故培养基设计应充分考虑营养物种类和含量，用“稀薄”培养基代替营养物过“浓”丰富培养基，节约原料，提升发酵产物产量兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第21页（二）选取和设计培养基方法生态模拟

自然基质或模拟：初级天然培养基肉汤、鱼汁果汁湿润麸皮米糠、米饭、面包查阅文件精心设计：优选法或正交试验试验比较培养皿琼脂平板摇瓶培养台式发酵罐兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第22页二、培养基种类对培养基成份了解培养基物理状态培养基对微生物功效兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第23页按对培养基成份了解来分天然培养基合成培养基半合成培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第24页天然培养基利用化学成份还不清楚或不恒定天然有机物制成培养基牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米粉、马铃薯、麸皮、动物组织器官浸出液、麦芽汁培养基特点营养丰富重复性差:成份复杂，每批成份不稳定适于试验室制备基础培养基及大生产种子培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第25页合成培养基用化学成份和量都确切知道高纯化学试剂配成培养基高氏一号（淀粉硝酸盐培养基）柠檬酸盐培养基葡萄糖铵盐培养基蔗糖硝酸盐培养基（察氏培养基）特点

重现性好、价格高、配制繁惯用于研究,不宜于大规模生产。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第26页半合成培养基由部分天然有机物和部分化学药品配成培养基。马铃薯蔗糖培养基特点

成本低、配制方便，用于生产、试验

兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第27页液体培养基固体培养基半固体培养基脱水培养基按物理状态分兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第28页液体培养基（LiquidMedium）未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，能够经过振荡或搅拌增加培养基通气量，同时使营养物质分布均匀。应用微生物生理、代谢研究取得大量菌体：营养物质以溶质状或高度分散态存在，微生物能充分与养料接触，微生物生长快发酵工业大规模生产：工业上常采取液体深层发酵法生产抗生素等各种微生物产品。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第29页固体培养基（SolidMedium）外观呈固态培养基，可在液体培养基中加入凝固剂成固体胨状凝固剂：对大多数微生物来说，琼脂是最理想凝固剂。1.5－2%琼脂：聚半乳糖硫酸酯5－12%明胶：蛋白质兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第30页理想凝固剂应具备条件1、不被所培养微生物分解利用；2、在微生物生长范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时，为预防因为高温引发培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂。3、凝固点温度不能太低，不然不利于微生物生长。4、对所培养微生物无毒害作用。5、在灭菌过程中不被破坏。6、透明度好、黏着力强。7、配制方便且价格低廉。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第31页惯用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶等，对大多数微生物来说，琼脂是最理想凝固剂。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第32页兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第33页固体培养基类型固化培养基

凝固剂：琼脂、明胶、海藻酸胶、脱乙酰吉兰糖胶、多聚醇非可逆固化培养基

血清培养基

无机硅胶培养基天然固态培养基

麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉

马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、大豆、面包

动植物组织培养基滤膜：醋酸纤维薄膜兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第34页固体培养基应用应用广泛菌种分离计数选种育种检验杂菌菌种保藏生物活性物质生物测定真菌孢子微生物固体培养和大规模生产兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第35页天然固体培养基如小米、大米、麸皮及马铃薯等可直接用作培养基培养霉菌、放线菌。小米麸皮等物质含有一定量碳源和能源物质，又含有大量矿质元素、微量元素和生长素，而且质地疏松透气，比表面大，是培养孢子和制备粗酶制剂良好培养基。如用麸皮培养黑曲霉生产糖化酶，培养米曲霉生产米曲霉孢子，用蒸煮大豆接种米曲霉进行固体培养，利用分泌蛋白酶制作豆酱等。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第36页液体培养基中加0.2-0.5%琼脂，表观呈固态，猛烈震荡后则破散。应用菌运动性、趋化性研究细菌、酵母菌菌种保藏厌氧菌培养分离和计数半固体培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第37页脱水培养基预制干燥培养基

含有除水以外一切成份商品培养基。使用时加适量水并加以灭菌即可生产商品化培养基企业

Merck兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第38页按培养基功效分基础培养基选择性培养基判别培养基其它培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第39页基础培养基尽管不一样微生物营养需求不一样，但大多数微生物所需基本营养物质是相同。基础培养基是含有普通微生物生长繁殖所需基本营养物质培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最惯用基础培养基。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第40页选择培养基用于将某种或某类微生物从混杂微生物群体中分离出来培养基。依据不一样种类微生物特殊营养需求或对某种化学物质敏感性不一样，在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，有利于所需微生物生长，抑制或杀死其它微生物。实例红曲霉耐高温耐酸泡菜加富性选择培养基抑制性选择培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第41页也称为营养培养基，即在基础培养基中加入一些特殊营养物质制成一类营养丰富培养基。如加入血、血清、动植物组织提取液等，以培养营养要求比较苛刻异养微生物。加富营养物：特殊碳源和氮源、甘露醇、纤维素和浓糖。该培养基中生长微生物并不是一个纯种，而是营养要求相同一类微生物，用于菌种保留或菌种分离筛选。加富性选择培养基兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第42页抑制性选择培养基在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离微生物无害，但能够抑制或杀死其它微生物。选择性抑菌剂：染料、抗生素、脱氧胆酸钠抗生素—抑制细菌、放线菌苯酚—抑细菌、霉菌制霉菌素—抑真菌结晶紫、牛胆酸盐—抑G+细菌亚硫酸铋—抑制革兰氏阳性菌和绝大多数革兰氏阴性菌兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第43页判别培养基添加特定试剂或化学药品对特定微生物判别、区分培养基。添加能够与目标菌无色代谢产物发生显色反应指示剂，从而能够用肉眼就能轻易地区分目标菌菌落培养基；伊红美蓝（EMB）平板

用于检验饮水和乳品中是否含肠道致病菌

E.coli呈紫绿色金属光泽，沙门氏菌菌落无色透明兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第44页EMB培养基组成EMB培养基成份/g蛋白胨：10乳糖：5蔗糖：5K2HPO4：2伊红Y：0.4美蓝：0.065蒸馏水：1000最终pH：7.2兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第45页兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第46页兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第47页培养基中惯用指示剂酸碱指示剂酚红溴甲酚紫溴荫香草酚蓝中性红中国蓝甲基红酸性复红氧化还原指示剂：美蓝和刃天青兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第48页1．配制：计算、称量、溶解2．调整pH：用3%HCI/NaOH调整，pH7.0-7.23．溶化琼脂

4．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引发污染。固体分装装量为管高1/5，半固体分装试管普通以试管高度1/3为宜分装三角烧瓶量以不超出三角烧瓶容积二分之一为宜。培养基配制编号成份含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第49页

5．灭菌任何培养基一旦配成，必须马上灭菌处理。只能灭菌一次。

常规高温蒸汽灭菌

（1.05kg/㎝2,

121.3℃,15-30min）一些成份进行分别灭菌过滤除菌兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第50页6．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板平板冷凝后，要将平板倒置。7．检验培养基制作是否合格：将灭菌培养基放入37℃温室中培养24—48小时，以检验灭菌是否彻底。兽医微生物学及免疫学课程组营养和培养基专家讲座第51页编号成份含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100m