植物蛋白质组学专家讲座

第一篇分子与细胞生物学基础

第三章植物蛋白质组学植物蛋白质组学专家讲座第1页

目录

1.蛋白质组和蛋白质组学

2.蛋白质组和基因组

3.植物蛋白质组研究方法

3.1蛋白质双向电泳

3.2氨基酸序列测定

3.3质谱

3.4生物信息学

4.植物蛋白质组学研究进展

4.1植物发育蛋白质组学研究

4.2植物环境蛋白质组学研究

4.3磷酸化蛋白质组学研究

5.植物蛋白质组学研究前景和挑战

5.1表示整体分析以及蛋白质组编目

5.2大规模蛋白质功效研究

5.3建立完整蛋白质调控网络植物蛋白质组学专家讲座第2页

1.蛋白质组和蛋白质组学蛋白质组：由一个基因组所表示全部蛋白质。蛋白质组学：研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织基因组所表示全部蛋白质。它不是按照传统方式孤立地研究某种蛋白质分子功效,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂细胞环境中功效。

蛋白质组学分为表示蛋白质组学和细胞图谱蛋白质组学。前者利用各种先进技术研究蛋白质表示整体改变,即研究在机体生长发育、疾病和死亡不一样阶段中,细胞与组织蛋白质组分改变;后者主要经过分离蛋白质复合物系统地研究蛋白质间相互作用植物蛋白质组学专家讲座第3页2.蛋白质组和基因组

蛋白质组和基因组关系：它们在概念上有相关性，代表某一蛋白质组蛋白质是由基因组编码，而基因功效是经过蛋白质表现出来。蛋白质组学研究远比基因组研究复杂：（1）蛋白质组复杂性远远高于基因组一个基因≠一个转录产物≠一个蛋白质基因→不一样转录起始和mRNA剪切→不一样mRNA→不一样翻译起始→不一样蛋白质→翻译后修饰→蛋白质功效、稳定性、细胞定位发生改变植物蛋白质组学专家讲座第4页

（2）基因组组成是固定，蛋白质组组成是动态。基因组在全部细胞中几乎都是相同，与之不一样，蛋白质组含有很高细胞和组织特异性。基因组是相对稳定，蛋白质组处于高度动态改变之中。（3）细胞内蛋白质拷贝数（108）远比基因拷贝数大（105）。（4）基因可采取PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有这些技术。

植物蛋白质组学专家讲座第5页

3.1蛋白质双向电泳

3.2氨基酸序列测定

3.3质谱技术

3.4生物信息学3.植物蛋白质组研究方法植物蛋白质组学专家讲座第6页蛋白质组研究技术路线流程图植物蛋白质组学专家讲座第7页3.1蛋白质双向电泳

蛋白质双向电泳(2-DE)：依据蛋白质等电点和相对分子质量不一样，分别经过第一维等电聚焦和第二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质混合物进行分离。

电泳后对蛋白质进行染色，惯用染色方法有考马斯亮蓝染色、银染以及蛋白质荧光检测方法。

蛋白质双向电泳图植物蛋白质组学专家讲座第8页3.1.1利用双向电泳研究植物蛋白质组基本流程

蛋白样品提取→双向电泳分离蛋白→蛋白质染色→双向电泳图谱分析

→蛋白点切割→蛋白酶解和判定

该流程最关键步骤是蛋白质样品提取，它关系到下游蛋白质分离和判定是否能够成功。好蛋白质样品要求从某一个细胞、组织或器官中提取尽可能多蛋白质，以最大程度地反应这个蛋白质组全貌。植物蛋白质组学专家讲座第9页3.1.2双向电泳缺点和处理方法

处理方法：

1.对样品进行前期分级

2.对不一样细胞器官或组织进行分离

3.使用宽胶条，符合重合窄IPG凝胶

4.双向荧光差异凝胶电泳

5.多块胶垂直二维SDS系统

6.双向电泳工作站植物蛋白质组学专家讲座第10页

经过使用不一样强度离液剂和表面去垢剂，并进行分步溶解分离，能够取得更多蛋白质，同时降低蛋白质样品复杂性，提升2-DE分辨率。如：ReadyPrep次序抽提试剂盒。

ReadyPrep试剂盒所需样品量较少，不需要额外设备，是一个既节约时间又节约设备好方法。

ReadyPrep

产品线包含一系列2-DE样品制备试剂盒，不但适合用于通用样品（总蛋白）处理，而且能够将复杂样品按特定方法分级。处理通用样品试剂盒包含总蛋白抽提和蛋白净化（clean-up）。样品分级试剂盒可用来降低样品复杂程度，同时有利于低丰度蛋白富集和判定。这类试剂盒又分为两种，一个是基于蛋白不一样亚细胞定位来分离，另一个是对细胞总蛋白进行分级。下面流程图将帮您确定哪种试剂盒对您更适合。

一.对样品进行前期分级植物蛋白质组学专家讲座第11页植物蛋白质组学专家讲座第12页

次序抽提试剂盒可将样品分离成3个递增溶解度组份。这3个分离份依次分离，使我们能观察到其它方法观察不到蛋白。经过对每一分离份逐层使用更强去垢剂，可提供递增溶解度.

试剂一试剂二试剂三植物蛋白质组学专家讲座第13页

二、对不一样细胞或组织进行分离

经过亚细胞分类，比如单独提取细胞壁、细胞核、细胞膜、线粒体和叶绿体等蛋白质组分。优点：降低蛋白质样品复杂性，提升分辨率，了解蛋白质定位。

三、使用宽胶条，符合重合窄IPG凝胶

2-DE分辨率通常认为与有效分离面积成正比，使用宽分离距离IPG胶和长距离二维SDS能够提升2-DE分辨率。选取不一样pH范围胶条，经过重合几次窄范围IPG凝胶电泳结果，能够提升在某一区段尤其是蛋白质集中区段内分辨率

植物蛋白质组学专家讲座第14页pH范围3—104—75.0—6.0上样量40ug80ug120ug植物蛋白质组学专家讲座第15页四.双向荧光差异凝胶电泳原理：双向荧光差异凝胶系统（DIGE）在传统双向电泳技术基础上，结合了多重荧光分析方法，在同一块胶上共同分离多个分别由不一样荧光标识样品，分析它们之间差异性。极大地提升了结果准确性，可靠性和重复性。

五.多块胶垂直二维SDS系统

优点：提升二维电泳效率和试验重复性

六.2-DE工作站优点：提升以2-DE为基础蛋白质组研究自动化程度和工作效率

植物蛋白质组学专家讲座第16页3.2氨基酸序列测定

氨基酸测序主要使用是N端测序Edman化学降解法。降解反应分三步进行：第一步：偶联反应，降解试剂（PITC）与多肽链游离氨基作用，形成PCT-肽。第二步：环化断裂反应，PCT-肽在无水强酸介质如三氟乙酸中，最靠近PTC基肽键将发生断裂，同时PTC-氨基酸残基环化成ATZ衍生物。第三步：转化反应，首先水解生成PTC-氨基酸，然后环化成PTH-氨基酸，其在紫外区有很强吸收峰。它能够被各种技术层析出来，然后判定。每轮Edman反应，能够判定一个氨基酸，剩下降低一个残基肽链便在它N端暴露一个新氨基，又可参加第二轮反应。植物蛋白质组学专家讲座第17页偶联反应环化断裂反应转化反应植物蛋白质组学专家讲座第18页3.3质谱质谱仪离心源质量分析器离子检测器基质辅助激光解吸电离（MALDI）电喷雾电离（ESI）飞行时间（TOF）四级杆（Q）离子阱（IT）惯用质谱仪有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里叶变换离子盘旋共振么质朴（FTMS）植物蛋白质组学专家讲座第19页进样系统离子源质量分析器检测器

质谱分析原理植物蛋白质组学专家讲座第20页TypicalresultfromMALDI-TOF植物蛋白质组学专家讲座第21页Peptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptides植物蛋白质组学专家讲座第22页各种质谱仪适用范围：MALDI-TOF-MS：分析判定一些相对比较简单多肽混合物和进行高通量蛋白质组研究。ESI-MS：分析复杂蛋白质样品，判定组成蛋白质氨基酸序列和蛋白质翻译后修饰。FTMS：判定氨基酸序列和分析蛋白质修饰。Bottom-up蛋白质组学：需要将蛋白质样品进行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白质组学：能够直接分析完整蛋白质样品，不需要经过2-DE前处理。如：FTMS植物蛋白质组学专家讲座第23页3.4生物信息学3.4.1蛋白质组数据库蛋白质组包含大量信息：蛋白质序列信息、加工和修饰信息、表示结构功效信息、与其它蛋白质形成复合物信息。

蛋白质数据库拟南芥数据库拟南芥蛋白数据库PAT苜蓿数据库DOME3.4.2蛋白质判定分析软件

比如：2-DE成像分析软件：Melanie,QUEST

蛋白质判定软件：MASCOT,PROWL植物蛋白质组学专家讲座第24页4.植物蛋白质组研究进展4.1发育蛋白质组学研究

发育蛋白质组：指植物在某一特定生长发育时期，在特定生长条件下，特定细胞、组织或器官中所表示全部蛋白质。

发育蛋白质组学：它揭示了在每一个特定时期所表示蛋白质和这些蛋白质在特殊生长时期可能发挥作用，是深入了解和深入研究蛋白质功效基础。双子叶植物：开展了根、茎、叶、花、种子和果实蛋白质组学组研究课题。单子叶植物：增加了叶鞘、花药、胚、胚乳等蛋白质组研究课题细胞器：细胞壁、内质网、细胞膜、叶绿体、线粒体等植物蛋白质组学专家讲座第25页4.2植物环境蛋白质组学研究

4.3磷酸化蛋白质组学研究

环境原因非生物原因：厌氧、冷、热、干旱、盐、重金属等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯等

研究与环境原因相关蛋白质，观察它们在逆境环境条件下表示量改变，并研究它们是怎样抵抗外界不利生长环境，维持细胞生命活动环境蛋白质组学：植物蛋白质组学专家讲座第26页

蛋白磷酸化是植物细胞将外界信号传递到细胞内一个主要伎俩，磷酸化能够改变蛋白质生物活性、亚细胞定位，影响蛋白质之间相互作用，更主要是这种改变是双向，及蛋白质活性、细胞定位等能够经过磷酸化和去磷酸化来调整。

研究现实状况：植物磷酸化蛋白质组研究还是以单个蛋白质为主，采取技术伎俩有Westernblot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶处理后蛋白质样品等。近年来伴随各种新技术发展，植物磷酸化蛋白质组研究也有了很大进展。比如用2-DE和MS/MS联用，坚定了马铃薯线粒体内14个磷酸化蛋白，拟南芥质膜磷酸化蛋白质组研究共判定了300多个磷酸化位点。植物蛋白质组学专家讲座第27页5.植物蛋白质组学研究前景和挑战

植物蛋白质组学研究与应用面临3个主要问题：

1.表示整体分析以及蛋白质组编目大规模整体性分析蛋白质在某一个细胞或组织中含量以及动态表示是蛋白质组学研究目标之一。

2.大规模蛋白质功效研究蛋白质最大挑战是判定每一个蛋白质以及它们异构体功效，一个较有前景策略是经过酵母双杂交系统整体性研究植物蛋白质之间相互作用。

3.建立完整蛋白质调控网络建立蛋白质调控网，不但能够提供蛋白质之间相互关系信息，而且还能够和基因组学、转录组学、代谢组学等信息联络起来。

植物蛋白质组学专家讲座第28页

谢谢植物蛋白质组学专家讲座第29页

基因组(DNA)

转录组(RNA)蛋白质组(PROTEIN)CitrateCycle代谢组(biochemicalmolecular)植物蛋白质组学专家讲座第30页植物蛋白质组学专家讲座第31页实例植物组织2-DE分析pH3

pH10100KD10KD物种：水稻组织名称：根部制备方法：液氮研磨+TCA-丙酮沉淀法上样量：5