核酸提取与鉴定

核酸提取与鉴定核酸提取与鉴定第1页研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等过程：

核酸提取裂解：破碎细胞，使细胞中核酸游离在裂解体系中

纯化：使核酸与裂解体系中其它成份，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离

核酸提取与鉴定第2页核酸提取主要步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜——内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸提取与鉴定第3页

总标准：

①应确保核酸一级结构完整性；②排除其它分子污染。判定：浓度、纯度、完整性判定技术：分光光度技术、凝胶电泳技术

核酸提取与鉴定第4页第一节预处理

一、样品预处理

1、组织

组织有新鲜组织、甲醛固定或石蜡包埋组织。

新鲜组织先用生理盐水洗，然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状，加细胞裂解液裂解细胞；

甲醛固定组织要先去掉甲醛；

石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。核酸提取与鉴定第5页2、培养细胞

培养细胞需弃细胞培养液，用缓冲液进行屡次漂洗，方可用于提取核酸。

核酸提取与鉴定第6页3、血液血液能够是新鲜血液或者冻贮血液；注意抗凝剂选择，普通用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不可使用肝素；全血离心弃血清（或血浆）、加适量红细胞裂解液（破膜液），裂解红细胞，再加适量细胞核裂液（破核液），裂解白细胞中细胞核，使核内DNA释放出来。核酸提取与鉴定第7页二、提取用具预处理（一）DNA提取用具处理试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。（二）RNA提取用具处理核酸提取与鉴定第8页1、提取RNA所用器皿处理及溶液准备塑料制品：使用灭菌一次性用具。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。玻璃用具：使用前于180℃高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有机玻璃电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。

核酸提取与鉴定第9页所需溶液配制：必须用高压灭菌水和RNA提取专用化学试剂配制溶液，用干烤过药匙称取试剂，把溶液装入无RNase玻璃器皿。严格来说，全部溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。核酸提取与鉴定第10页

在包括RNA一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。2．RNA提取中RNase污染控制

核酸提取与鉴定第11页第二节DNA提取

一、DNA常规提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP)存在于细胞核中，所以要从细胞中提取DNA时，必须先粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使核蛋白释放，再把蛋白质除去，再除去细胞中糖类，脂类、RNA等物质，沉淀DNA,去除盐类，有机剂等杂质,得到纯化DNA。核酸提取与鉴定第12页1、酚-氯仿提取法

核酸提取与鉴定第13页2、浓盐法

核糖蛋白（RNP）与脱氧核糖蛋白（DNP）在不一样浓度NaCl溶液中溶解度显著不一样。DNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小，仅为水中1％。当NaCl浓度增至1mol/L时，DNP溶解度比在水中大2倍。利用这一性质可将DNP从破碎后细胞匀浆中分离出来，也能够使DNP和RNP分离，DNP蛋白个别可用苯酚、SDS等其它方法将其除去。

核酸提取与鉴定第14页3、玻璃棒缠绕法用盐酸胍裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中乙醇上，用一个代沟或前端为U型玻璃棒在这两层溶液交界面慢慢搅动，沉淀出胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上DNA经屡次乙醇浸泡并与室温下蒸发乙醇，由胶状逐步回缩，然后浸入TE缓冲液中，使其重新吸水膨胀而和玻璃棒分离。核酸提取与鉴定第15页4、玻璃颗粒吸附法

首先利用含异硫氰酸胍细胞裂解液裂解细胞，然后加入能够与DNA结合玻璃颗粒缓冲液，经沉淀搜集结合DNA玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱取得DNA。不但玻璃颗粒能够和DNA结合，一定大小硅胶颗粒也能够和DNA结合。核酸提取与鉴定第16页二、质粒DNA提取（1）是存在于细菌染色体外小型环状双链DNA分子。（2）小1-3kb，大可达数百kb。（3）进入细菌，可自我复制或表示。核酸提取与鉴定第17页质粒DNA提取有效方法方法：碱裂解法；氯化铯密度梯度分离法；煮沸裂解法等。全部分离质粒DNA方法都包含3个基础步骤：培养细菌使质粒扩增；搜集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，依据试验所需)选择哪一个方法主要取决于以下几个原因：质粒大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化技术和试验要求。核酸提取与鉴定第18页1、培养细菌和扩增质粒

用氯霉素抑制宿主细胞蛋白质合成，从而抑制染色体复制和分裂；质粒复制系统成份半衰期较长，使质粒得以扩增。核酸提取与鉴定第19页2、收获细菌和溶菌细菌裂解三种方法：机械法（如超声波等）化学试剂法（如SDS等）溶菌酶－化学试剂联正当（最常见）核酸提取与鉴定第20页3、提取质粒主要使染色体DNA与质粒DNA分离

分离主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA轻易发生变性，共价闭环质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象。核酸提取与鉴定第21页

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够快速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来（1）碱裂解法核酸提取与鉴定第22页（2）氯化铯密度梯度分离法

EB分子可嵌入碱基对之间，使DNA解旋开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小。闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少许EB，密度较大。在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA。核酸提取与鉴定第23页（3）煮沸裂解法经过加热，使细菌裂解、蛋白质和染色体DNA变性。降低温度，闭环质粒DNA复性留于上清液，染色体DNA不能复性与变性蛋白质形成沉淀，可经过离心出去而分离。核酸提取与鉴定第24页第三节RNA提取一、总RNA提取全部RNA提取过程中都有五个关键点，即：①样品细胞或组织有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高样品还牵涉到多糖杂质有效除去。但其中最关键是抑制RNA酶活性。核酸提取与鉴定第25页常见RNA酶抑制剂

①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一个强烈但不彻底RNA酶抑制剂。②异硫氰酸胍：当前被认为是最有效RNA酶抑制剂。③氧钒核糖核苷复合物④RNA酶蛋白抑制剂(RNasin)⑤其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。核酸提取与鉴定第26页RNA提取方法

1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法

使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶活性，再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。使用这种方法，不但能得到高质量RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA。本法已成为提取哺乳动物细胞RNA常规方法。

核酸提取与鉴定第27页2、盐酸胍-有机溶剂法盐酸胍变性蛋白质，抑制RNA酶，有机溶剂抽提去除蛋白质，经过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。此法适合用于没有超速离心设施情况下提取细胞总RNA，提取RNA质量很好，但整个操作过程繁杂费时。核酸提取与鉴定第28页3、氯化锂-尿素法利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA，如5sRNA等。优点是快速、简便、产量高，尤其适合用于大量样品少许组织细胞RNA提取。核酸提取与鉴定第29页4、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠（SLS）等联合使用，抑制RNA降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物解离，使RNA与蛋白质分离；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少许组织细胞RNA提取均甚适当。核酸提取与鉴定第30页

二、mRNA提取

从提取总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）-柱层析法分离：mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其它成份被洗掉，再经过低盐浓度洗脱mRNA而分离。核酸提取与鉴定第31页第四节核酸判定一、核酸浓度检测1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，依据元素分析获知RNA平均含磷量为9.4%，DNA平均含磷量为9.9%，所以可从样品中测得含磷量来计算DNA或RNA含量。

2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，依据这两种糖颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。核酸提取与鉴定第32页3、紫外吸收法DNA和RNA在波长260nm处有很高吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀释倍数/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀释倍数/1000核酸提取与鉴定第33页二、核酸纯度检测

核酸纯度用A260/A280比值表示。OD260/OD280

＝1.8——为DNA纯品OD260/OD280

＝1.8~2.0——为RNA纯品核酸提取与鉴定第34页三、核酸完整性检测核酸样本完整性和分子量可经过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采取甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清楚条带。完整性良好总RNA应该清楚地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA三条带，其中28srRNA亮度应为18srRNA两倍，5srRNA较弱。

核酸提取与鉴定第35页

基因组DNA抽提结果电泳图核酸提取与鉴定第36页总RNA抽提结果电泳图mRNA核酸提取与鉴定第37页第五节电泳依据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：多用于判定较大核酸片段（0.1～60kb），尤其是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于判定较小核酸片段，尤其是DNA测序核酸提取与鉴定第38页电泳基础原理电泳是指带电颗粒在电场作用下发生迁移过程。许多主要生物分子，如蛋白质、核酸等都含有可电离基团，它们在某个特定pH值下能够带正电或负电，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷性质相反电极方向移动。电泳技术就是利用在电场作用下，因为待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质差异，使带电分子产生不一样迁移速度，从而对样品进行分离、判定或提纯技术。

核酸提取与鉴定第39页一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一个非常简便、快速、最常见分离、纯化和判定核酸方法。琼脂糖是从琼脂中提纯出来一个线性多糖。琼脂糖凝胶制作是将适量琼脂糖粉末悬浮于缓冲液中，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。凝胶含有刚性滤孔，凝胶孔径大小决定于琼脂糖浓度，低浓度琼脂糖形成较大孔径，而高浓度琼脂糖形成较小孔径。核酸提取与鉴定第40页琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度(％)线型DNA分子分离范围(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2核酸提取与鉴定第41页琼脂糖凝胶电泳装置核酸提取与鉴定第42页DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不一样DNA分子量大小及构型不一样，电泳时泳动率就不一样，从而分出不一样区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子大小使其分离。核酸提取与鉴定第43页RNA能够使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，能够分离混合物中不一样分子量RNA分子，不过无法确定分子量。只