植物遗传转化体系的建立专家讲座

第十三章

植物遗传转化体系建立

植物遗传转化体系的建立专家讲座第1页第一节植物基因转化受体体系

转基因植物是指利用重组DNA技术将外源优良目标基因整合到植物基因组中，并使其得以表示，从而取得含有新遗传性状植物。转基因技术基础是良好受体体系，所以，建立了高效稳定受体体系，才能进行植物转基因操作和应用。植物遗传转化体系的建立专家讲座第2页植物基因转化受体体系是指将用于基因转化外植体---利用组织培养路径或其它非组织培养路径，建立高效、稳定并能接收外源基因整合以及对转化筛选抗生素较敏感再生系统。良好基因转化受体体系建立是成功实现观赏植物遗传转化基础，而适当转化受体体系要有高效稳定再生能力。

植物遗传转化体系的建立专家讲座第3页理想受体材料是：

细胞既要能有效地接收外源目标基因，还应由单细胞分化再生植株，降低假阳性植株和嵌合体。当前惯用外植体有原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、胚状体、叶圆盘、叶片、茎段、下胚轴、无性胚等。

其次，受体材料特征，包含受体材料生理状态，受体再生能力和再生路径，体细胞无性系变异发生等。

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再次，适宜诱导和筛选条件，如培养基种类和组成，筛选剂种类、浓度，筛选时间等都会影响到转基因细胞分化和抗性植株再生。

最终，观赏植物基因转化受体体系要有较高遗传稳定性，要求受体系统在接收外源DNA后不应影响其正常生长、分裂、发育、分化，并能稳定地将接收外源DNA遗传给后代，尽可能降低变异。

植物遗传转化体系的建立专家讲座第5页一、直接分化受体体系

是外植体直接分化出不定芽取得再生植株而建立受体体系。

①取得再生植株操作简单，周期短。

②体细胞无性系变异小，取得再生植株其遗传性质十分稳定，尤其是由茎尖分生组织经过直接分化建立再生系统其遗传稳定性更佳。

但通常由外植体直接分化成芽难度较大，再生频率较低。同时不定芽再生经常起源于多细胞，轻易存在嵌合体。植物遗传转化体系的建立专家讲座第6页二、愈伤组织

愈伤组织受体体系是外植体经过脱分化形成愈伤组织再取得再生植株而建立受体体系。

①由分生细胞组成，易于接收外源目标DNA，转化效率较高。

②繁殖系数快速增加，能够取得大量转化植株。

③适合于经过直接分化难以取得再生植株植物和对应外植体，尤其是单子叶植物和木本植物。

愈伤组织通常是由多细胞组成，易产生嵌合体；同时取得再生植株无性系变异较大，外源基因整合稳定性较差。植物遗传转化体系的建立专家讲座第7页三、原生质体

在进行植物遗传转化之前要尽可能选取与母本遗传一致外植体来建立有效再生体系。原生质体是植物遗传转化中应用最广、理想受体材料之一。

特点有：

①去除了细胞壁妨碍，能够直接高效地接收外源DNA并整合到染色体上。

植物遗传转化体系的建立专家讲座第8页②原生质体生理生化特征几乎一致，便于在相对均匀、稳定同等条件下实现目标基因表示、转化、判定。

③原生质体经过培养易于形成基因型一致细胞系，较易防止嵌合体产生，性状也易纯化且稳定遗传。

④受体体系可适合于各种转基因方法。

但原生质体培养技术要求高、过程复杂、周期长，取得再生植株频率较低；同时原生质体培养形成细胞无性系变异强烈，再生植株变异频率较高，限制了原生质体作为遗传转化受体应用。植物遗传转化体系的建立专家讲座第9页四、悬浮细胞

基因转化受体体系特点是：

①生长快速，重复性好，易于接收外源DNA，转化效率较高。

②悬浮细胞主要是由单细胞、小细胞团组成，可有效克服转基因植株中存在嵌合表达象。

③悬浮细胞培养条件易于控制，便于进行转化体筛选。

但建立良好细胞悬浮系受植物基因型影响较大，且耗时较长，普通需要3～6个月时间。同时伴随继代培养时间延长，胚性悬浮细胞再生能力会逐步丧失，并造成突变体产生。植物遗传转化体系的建立专家讲座第10页五、胚状体

体细胞胚发生含有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，同时体细胞胚产生起源于单细胞，能在突变体育种和基因重组育种中克服嵌合表达象。体细胞胚受体体系特点是：

1.发育成胚状体胚性细胞含有较强分裂特征和接收外源目标DNA能力，是理想基因转化感受态细胞，同时这些胚性细胞繁殖量大，同时性好，转化效率高。植物遗传转化体系的建立专家讲座第11页2.胚状体发生是单细胞起源，所以取得转基因植株嵌合体少。

3.胚状体含有两极性，即在发育过程中能同时分化出芽和根，克服了一些植物由不定芽难以生根缺点。植物遗传转化体系的建立专家讲座第12页4.与植物器官再生方式相比，胚状体发生速度快、数量多、结构完整、再生率高，胚状体个体间遗传背景一致，不轻易产生变异，使取得转基因植株遗传稳定性好。

5.与周围细胞存在隔离区，和培养物没有维管束联络，轻易从培养物上剥离。

6.利用胚状体可生产人工种子。植物遗传转化体系的建立专家讲座第13页六、生殖细胞受体体系（种质系统）

利用植物生殖细胞如花粉粒、卵细胞等为受体细胞进行基因转化系统叫生殖细胞受体系统，也称种质系统。

当前主要经过两个路径建立生殖细胞受体系统。

1、利用植物组织培养技术进行花药培养和花粉培养，经过诱导出胚性细胞或愈伤组织，取得单倍体植株，建立单倍体基因转化受体体系。

2、直接利用花粉和卵细胞受精、发育过程进行遗传转化，如花粉管通道法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。植物遗传转化体系的建立专家讲座第14页生殖细胞基因转化受体系统特点有：

①生殖细胞再生能力强，接收外源目标基因能力也强，转化效率高。

②生殖细胞是单倍体细胞，转化基因无显隐性影响，能提升外源基因表示效率，有利于性状选择。经过加倍后能取得纯合二倍体。

③跟传统育种技术结合，能缩短复杂育种纯化过程，简化种质创新程序。

④易于取得稳定遗传转基因植株。植物遗传转化体系的建立专家讲座第15页第二节植物基因转化方法

一、载体转化方法

（一）根癌农杆菌介导转化法

根癌农杆菌是普遍存在于土壤中一个革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段可转移DNA（T-DNA），农杆菌经过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，而T-DNA插入外源DNA片段并不影响整合。植物遗传转化体系的建立专家讲座第16页（二）植物病毒法

植物病毒作为潜在转化载体，含有易于浸染、拷贝数多和开启外源基因表示能力强特点，因而引发人们极大兴趣，其中最有希望是花椰菜花叶病毒（CaMV），已经有试验证实它能进入宿主细胞并得以扩增及传输。植物遗传转化体系的建立专家讲座第17页二、DNA理化转移方法不依赖于农杆菌载体和其它生物媒体，将经过特殊处理裸露外源DNA直接导入植物细胞，实现基因转化方法叫DNA直接导入转化，该转化技术依据原理可分为物理法和化学法2种。物理法是基于很多物理原因对细胞膜影响，或经过机械损伤直接将外源DNA导入细胞，；化学法借助于特定化学物质诱导DNA直接导入植物细胞。植物遗传转化体系的建立专家讲座第18页第三节转基因植株再生及检测

一、转基因植株再生

植物转基因方法众多，转基因植株再生方法也各异。植物遗传转化体系的建立专家讲