大肠杆菌感受态细胞专家讲座

大肠杆菌感受态细胞制备、重组DNA转化、克隆筛选大肠杆菌感受态细胞专家讲座第1页1.试验目标和要求经过本试验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞技术以及筛选转化体技术。了解细胞转化概念及其在分子生物学研究中意义。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第2页2.相关知识及原理感受态细胞(Competentcells):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）处理后，细胞膜通透性发生改变，成为能允许多有外源DNA载体分子经过感受态细胞(competentcell)。

大肠杆菌感受态细胞专家讲座第3页转化（transformation）：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞取得新遗传性状一个伎俩，是基因工程等研究领域基本试验技术。

进入细胞DNA分子经过复制表示，才能实现遗传信息转移，使受体细胞出现新遗传性状。转化过程所用受体细胞普通是限制－修饰系统缺点变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶突变株。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第4页转化方法：化学方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl）制备感受态细胞，经过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备感受态细胞，经过高压脉冲作用将载体DNA分子导入受体细胞。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第5页克隆筛选：主要用不一样抗生素基因筛选。惯用抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；大肠杆菌感受态细胞专家讲座第6页将经过转化后细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较轻易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子受体细胞。不然，假如将转化后菌液涂在无选择性抗生素培养基平板上，会出现成千上万细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化质粒。即使只有那些含有被转化质粒细菌才能在含有抗生素平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第7页重组质粒克隆判定判定带有重组质粒克隆方法惯用有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选方法。最惯用方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因载体还能够结合-互补现象来筛选。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第8页-互补现象：因为有些载体都带有一个LacZ基因调控序列和头146个氨基酸编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码缺点型-半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。当这种载体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，即使它们各自都没有酶活性，但它们能够融为一体形成含有酶活性蛋白质。所以称这种现象为

-互补现象。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第9页由互补产生－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－

－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色菌落，所以利用这个特点，在载体该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(

)基因失活，破坏-互补作用，就不能产生含有活性酶。所以，有重组质粒菌落为白色，而没有重组质粒菌落为蓝色。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第10页大肠杆菌感受态细胞专家讲座第11页重组DNA转化细菌过程示意图大肠杆菌感受态细胞专家讲座第12页3．仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；菌株：E.coliDH5α质粒：pBluscriptKS+DNA片段重组质粒以及pBluscriptKS空质粒；LB培养基；含抗菌素LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100µg／mL，X-gal20-48µg/ml,IPTG100µg/ml。普通将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000贮备液，用时按培养基量再加入）；预冷CaCl2溶液（0.1mol／L）大肠杆菌感受态细胞专家讲座第13页4．操作步骤

1）大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl2法)（1）从新活化E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长久。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停顿培养；大肠杆菌感受态细胞专家讲座第14页（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，全部操作均在冰上进行，速度尽可能快而稳）；（3）倒净上清培养液，用1ml冰凉0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；（4）0～4℃，4000r／min离心10min；（5）弃去上清液，加入500µl冰凉0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；大肠杆菌感受态细胞专家讲座第15页（6）弃去上清液，加入100µl冰凉0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好感受态细胞悬液可直接用于转化试验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保留六个月至一年。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第16页2）细胞转化

(1)分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保留液，则需化冻后马上进行下面操作)，第一组，加入10µl重组质粒DNA(体积不超出10µl)+100µl感受态细胞，此管为转化试验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng+100µl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng未酶切pBluescript质粒DNA十100µl感受态细胞悬液。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第17页(2)将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后快速冰上冷却2min(3)马上向上述管中分别加入0.4mlLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表示抗生素基因产物(Ampr)。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第18页3)平板培养（有时需要稀释）取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（假如用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第19页(2)菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未相互重合时停顿培养，对于能够蓝白斑筛选质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用CaCl2法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上转化菌落足以满足普通克隆试验。大肠杆菌感受态细胞专家讲座第20页4)检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中菌落数，各试验组培养皿内菌落生长情况应如表所表示:

大肠杆菌感受态细胞专家讲座第21页组含抗