单基因遗传病的研究策略

单基因遗传病的研究策略单基因遗传病的研究策略第1页假如一个遗传病发病仅仅包括到一个基因，这个基因称为主基因(majorgene)，其造成疾病称为单基因病。单基因遗传病单基因遗传病的研究策略第2页单基因遗传病发病复杂性外显率：一定基因型个体表现出疾病表型百分比表现度：相同基因型不一样个体在疾病表现程度差异基因多效性：一个基因有各种生物学效应遗传异质性：表型相同而基因型不一样现象从性遗传和限性遗传：常染色体上基因在不一样性别有不一样表示程度和表示方式，从而造成男女性状分布上差异遗传早现现象：疾病在世代中存在发病年纪逐步提前或病情逐代加重情况单基因遗传病的研究策略第3页研究策略与方法临床诊疗、家系调查与材料搜集侯选基因确实定已知致病基因突变位点确实定连锁分析与未知基因基因定位基因型与表现型相关性研究发病机制研究单基因遗传病的研究策略第4页临床诊疗、家系调查与材料搜集单基因遗传病的研究策略第5页临床诊疗查阅相关资料，认识不一样遗传病患者临床表现及其辅助诊疗办法临床诊疗：症状和体征常规辅助检测指标特殊诊疗指标单基因遗传病的研究策略第6页家系调查与系谱分析调查家系三代以上全部相关组员信息依据调查资料，用系谱中常见符号绘制成系谱系谱分析：区分遗传病与非遗传病区分单基因与多基因病判断遗传方式单基因遗传病的研究策略第7页大家系单基因遗传病的研究策略第8页散发病例单基因遗传病的研究策略第9页临床遗传病家系特点散发病例：对于遗传病，包含单基因遗传病，多数病例表现为散发。小家系病例：在有家族史病例中，多数也是小家系。大家系病例：极少数家系发病个体多，包括3-4代都有患者。单基因遗传病的研究策略第10页搜集材料采集样品：

外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊,

病人组织（如能够取材），羊水（产前诊疗）采集家系应做到尽可能完整患者、同一家系中有相同遗传背景表型正常其它个体、该家系中其它遗传背景组员单基因遗传病的研究策略第11页搜集临床资料病人临床上一系列指标检测保留相关信息和影象资料病人血清或组织保留及其酶、病理或免疫学研究单基因遗传病的研究策略第12页侯选基因确实定单基因遗传病的研究策略第13页文件检索数据库

中OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）数据库中整合了当前已定位单基因病信息确定自己所研究家系可能已知候选基因或已定位染色体候选区域单基因遗传病的研究策略第14页依据疾病名称检索单基因遗传病的研究策略第15页依据基因检索单基因遗传病的研究策略第16页检索最新文件单基因遗传病的研究策略第17页确定已知致病基因突变单基因遗传病的研究策略第18页取得已知基因基因组序列设计引物或参考文件中引物依据文件，采取适当技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）从数据库中查阅目标基因相关信息单基因遗传病的研究策略第19页

PCR-测序分析MFN2基因结果发觉错义突变:c.281

G>A,其所在密码子由CGG变为CAG,造成其编码氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺.结论：经查阅文件资料，c.281

G>A为已知致病突变位点，可判断其为该患者致病突变位点。

单基因遗传病的研究策略第20页依据变异造成结果判断依据突变数据库和文件资料排除已知SNP依据家系共分离是否判断在正常对照人群中分析保守性分析基因功效分析突变分析结果判断单基因遗传病的研究策略第21页连锁分析与未知基因基因定位单基因遗传病的研究策略第22页

利用被定位基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。连锁分析注：适于分析较大遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例单基因遗传病的研究策略第23页连锁

重组单基因遗传病的研究策略第24页遗传标识进行连锁分析时需要一些已知遗传位点，这些位点应按孟德尔方式遗传，且含有多态性方便显示连锁关系，这些标识位点称为遗传标识RFLP，STR,SNP单基因遗传病的研究策略第25页连锁分析结果单基因遗传病的研究策略第26页连锁分析结果单基因遗传病的研究策略第27页基因定位：将致病基因确定到染色体实际位置未知致病基因定位克隆研究基因克隆：确定致病基因单基因遗传病的研究策略第28页定位克隆基础方法和步骤搜集家系，选择遗传标识进行连锁分析，对目标基因作图定位确定候选位置，对目标基因进行精细定位从候选基因中确定正确基因（二代测序技术）单基因遗传病的研究策略第29页例：一个X连锁肌肉病家系致病基因定位克隆研究

单基因遗传病的研究策略第30页家系情况及前期研究基础先证者Ⅲ2临床表现近似DMD排除了DMD/EMD/FHL1基因突变单基因遗传病的研究策略第31页研究策略SNP芯片分析精细定位分析基因查阅外显子组测序全基因组90万个SNP位点；8例样本；商业企业完成选取数个SNP点；增加3个组员连锁区域内基因：MapViewer；基因表示：UniGene数据库及HGNC网站；基因功效：OMIM数据库1例样本(I2)；商业企业完成单基因遗传病的研究策略第32页SNP芯片数据分析

连锁分析

提醒X染色体有三段连锁区域：单基因遗传病的研究策略第33页单体型分析单基因遗传病的研究策略第34页

GenemaplocusGRCh37.p5

PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)GeneticMap(Marshfield)(cM)

Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49

Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62

Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区域单基因遗传病的研究策略第35页精细定位分析将Xp22.32-p22.2连锁区域由6.78Mb缩短为4.18Mb

单基因遗传病的研究策略第36页排除Xp21.2-p21.1连锁区域单基因遗传病的研究策略第37页必定Xq24-q27.2连锁区域单基因遗传病的研究策略第38页最终确定两段连锁区域Genemap

locusGRCh37.p5

PrimaryAssembly(STS)Physicaldistance(Mb)GeneticDistance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06

单基因遗传病的研究策略第39页连锁区域内包含基因Xp22.32-p22.2连锁区域共28个基因：14个已知基因,14个预测基因14个已知基因：6个基因在肌肉组织中表示（3个基因表型已知，均与肌肉病无关）7个基因不在肌肉组织表示1个基因表示情况未知

单基因遗传病的研究策略第40页Xq24-q27.2连锁区域共272个基因：122个已知基因,150个未知基因122个已知基因：79个基因在肌肉组织中表示（18个基因表型已知，其中包含前期已经排除FHL1基因）41个基因不在肌肉组织表示2个基因表示情况不清楚

单基因遗传病的研究策略第41页外显子组测序平均覆盖度：23.8×；覆盖度大于>20×位点占53.7%在上述两个连锁区域测序深度均很低对测序深度>20变异位点进行验证，结果均无变异单基因遗传病的研究策略第42页存在问题及处理方法本家系患者未进行肌肉活检将进行多个样本外显子组测序单基因遗传病的研究策略第43页Genotype和Phenotype相关性研究单基因遗传病的研究策略第44页例：非综合征型先天缺牙分子遗传学研究

JDentRes,;88:126-131EurJMedGenet,;51:536-546EurJMedGenet,;54:377-382单基因遗传病的研究策略第45页单基因遗传病发病机制研究单基因遗传病的研究策略第46页——隐性突变往往造成失去功效（lossoffunction）——显性突变可造成取得功效（gainoffunction）和失去功效失去功效：单倍剂量不足（halpoinsufficency）取得功效：显性负效应（dominantnegtive）

隐性突变和显性突变致病机制单基因遗传病的研究策略第47页Gainoffunction：

Loricrin基因突变取得核转位新功效

BrJDermatol,;159:714-719

单基因遗传病的研究策略第48页Loricrin角皮病单基因遗传病的研究策略第49页连锁分析与1q21区域连锁单基因遗传病的研究策略第50页发觉Loricrin基因新突变单基因遗传病的研究策略第51页特殊临床表现单基因遗传病的研究策略第52页突变蛋白序列新功效预测单基因遗传病的研究策略第53页GFP表示载体构建单基因遗传病的研究策略第54页细胞亚定位分析单基因遗传病的研究策略第55页动物模型过表示和基因敲除小鼠模型均表现正常表型转基因小鼠表现出与人类疾病相同疾病表型，提醒突变基因取得功效为其发病机制。单基因遗传病的研究策略第56页基因敲除小鼠表型基础正常单基因遗传病的研究策略第57页转基因小鼠表型与人类疾病相同单基因遗传病的研究策略第58页结论

Loricrin基因突变可引发新疾病表型Loricrin突变蛋白取得新功效，经过其核定位信号介导了突变蛋白核转位单基因遗传病的研究策略第59页Haploinsufficiency：

PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程造成糖耐受异常

Diabetologia.;52:504-13单基因遗传病的研究策略第60页先天性无虹膜家系单基因遗传病的研究策略第61页在该家系发觉

PAX6突变(c.1080C>T)造成单倍剂量不足

SSCPanalysis

DNAsequencing

单基因遗传病的研究策略第62页Tonetal.Cell67,1991PAX6

基因及其cDNA单基因遗传病的研究策略第63页Essentialforthedevelopmentoftheeye&brain

homozygous

mutants—noeyes,nobrain,die

heterozygousmutants—smalleyesinmiceaniridiainhumansEssentialforthedevelopmentofpancreas

homozygous

mutants—abnormalpancreaticstructurePAX6功效Hilletal.Nature354,1991;St-Ongeetal.Nature387,1997;Sanderetal.GenesDev11,1997单基因遗传病的研究策略第64页PAX6在胰腺发育中功效Mansourietal.TEM10,1999Dohrmannetal.MechDev92,单基因遗传病的研究策略第65页

PAX6在成体胰腺中功效Homozygousmicewithconditionalk/oPAX6inthepancreascauseddiabetes

FouraniridiapatientswithPAX6mutationswerereportedtosufferfromglucoseintolerance

Ashery-Padanetal.DevBiol269,Yasudaetal.Diabetes51,

单基因遗传病的研究策略第66页假说PAX6mutation?abnormalglucosehomeostasis单基因遗传病的研究策略第67页OGTTAnalysisintheAniridiaPedigreeIDAgeBMI(kgm-2)Glucoselevels(mmolL-1)ClinicalstatusAniridiaGenotype0’120’

Ⅱ-6Ⅱ-7Ⅲ-2Ⅲ-3Ⅲ-5Ⅲ-6Ⅲ-8Ⅲ-9Ⅲ-10Ⅲ-11Ⅲ-13706850434133304038363217.5820.2217.8820.8621.1520.4220.9920.4320.9622.9320.834.554.084.865.253.694.274.916.055.277.744.668.0412.9911.418.657.806.625.8814.579.7815.617.31IGTDDIGTIGTNGTNGTDIGTDIGT+++++++++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅣ-1Ⅳ-2Ⅳ-5Ⅳ-7Ⅳ-9171811161419.4120.3315.2819.4116.194.173.984.725.144.587.956.855.666.217.07IGTNGTNGTNGTNGT+

++++m/Nm/Nm/Nm/Nm/NⅢ-15Ⅲ-16Ⅲ-17Ⅲ-18Ⅲ-19Ⅳ-3Ⅳ-4Ⅳ-6Ⅳ-84138343330151171219.9321.1922.3020.4322.8317.3115.4215.0616.544.414.894.254.014.384.155.244.814.716.765.335.036.006.635.485.086.186.23NGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGTNGT---------N/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/NN/N单基因遗传病的研究策略第68页血糖和胰岛素水平单基因遗传病的研究策略第69页总结1AniridiacausedbyPAX6genemutationPAX6mutationcausedimpairedglucosetolerance(IGT)PAX6-relatedIGTwasassociatedwithage单基因遗传病的研究策略第70页问题DoesIGTcomefromdeficiencyofinsulin?Dothesepatientshaveinsulinresistance?Dopatientshaveadefectininsulinprocessing?

单基因遗传病的研究策略第71页PAX6HadNoEffectontheTran