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基因敲除技术基因敲除技术第1页基

因

敲

除1.基因敲除介绍2.基因敲除方法及其原理3.基因敲除应用基因敲除技术第2页基因敲除介绍汉字名称：基因敲除或基因剔除英文名称：geneknock-out;geneknockout定义1：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性技术。去除原核生物细胞、真核生物生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中基因等。广义基因敲除包含某个或一些基因完全敲除、个别敲除、基因调控序列敲除以及成段基因组序列敲除。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性方法。敲除基因用以观察生物或细胞表型改变，是研究基因功效主要伎俩。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：在基因组水平上改变或破坏靶基因结构，使其功效完全丧失试验技术。所属学科：遗传学（一级学科）；发育遗传学（二级学科）基因敲除技术第3页基因敲除介绍定义：经过一定路径使机体特定基因失活或缺失技术。1234567123456790890基因敲除基因敲除技术第4页基因敲除方法及其原理通常意义上基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计同源片段替换靶基因片段，从而到达基因敲除目标。伴随基因敲除技术发展，除了同源重组外，新原理和技术也逐步被应用，比较成功有基因插入突变和RNAi，它们一样能够到达基因敲除目标。基因敲除技术第5页基因敲除技术同源重组法插入突变法RNAi法基因敲除技术第6页利用基因同源重组进行基因敲除利用同源重组构建基因敲除动物模型基础步骤（以小鼠为例）7基因敲除技术第7页a.基因载体构建

把目标基因和与细胞内靶基因特异片段同源DNA分子都重组到带有标识基因载体上，成为重组载体。基因敲除技术第8页b．ES细胞取得：

现在基因敲除普通采取是胚胎干细胞，最常见是鼠，而兔，猪，鸡等胚胎干细胞也有使用。ｃ.同源重组：

将重组载体经过一定方式导入同源胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中对应个别发生同源重组，将重组载体中DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表示基因敲除技术第9页ｄ．选择筛选已击中细胞：

当前常见方法是正负筛选法（PNS法），标识基因特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多是PNS法。ｅ．表型研究：

经过观察嵌和体小鼠生物学形状改变进而了解目标基因改变前后对小鼠生物学形状改变，到达研究目标基因目标。基因敲除技术第10页f．得到纯合体：

因为同源重组经常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以假如要得到稳定遗传纯合体基因敲除模型，需要进行最少两代遗传。基因敲除技术第11页基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原剪发展起来。该方法经过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点，以到达定点修饰改造染色体上某一基因目标，克服了随机整合盲目性和偶然性，是一个理想修饰、改造生物遗传物质方法。直到现在，利用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍使用方法。基因敲除技术第12页利用随机插入突变进行基因敲除

此法利用一些能随机插入基因序列病毒，细菌或其它基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变细胞库，然后经过对应标识进行筛选取得对应基因敲除细胞。

基因捕捉法是最近发展起来利用随机插入突变进行基因敲除新型方法。技术原理：基因敲除技术第13页插入载体选择：依据细胞不一样，插入载体选择也有所不一样。1)逆转率病毒可用于动植物细胞插入；2)植物细胞中农杆菌介导T-DNA转化和转座子比较常见；3）噬菌体可用于细菌基因敲除。基因敲除技术第14页基因捕捉法优点

面对人类基因组计划产生出巨大功效未知遗传信息，传统基因敲除方法显得有些力不从心。所以，基因捕捉法应运而生，利用基因捕捉能够建立一个携带随机插入突变ES细胞库，节约大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体工作及费用，更有效快速地进行小鼠染色体组功效分析。

基因捕捉法缺点

只能剔除在Es细胞中表示基因。用基因捕捉法进行基因剔除另一个缺点是无法对基因进行精细遗传修饰。基因敲除技术第15页RNAi引发基因敲除RNAi基因敲除优点及应用

①.比用同源重组法愈加简便，周期大大缩短。

②.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡基因，能够在体外培养细胞中利用RNAi技术研究它功效。

③.因为RNAi能高效特异阻断基因表示，它成为研究信号传导通路良好工具。

④.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用基因，如可用RNAi来阻断一些基因表示，来研究他们是否在胚胎干细胞增殖和分化过程中其起着关键作用。基因敲除技术第16页基因敲除技术应用①．建立生物模型

在基因功效，代谢路径等研究中模型生物建立非常主要。基因敲除技术就经常见于建立某种特定基因缺失生物模型，从而进行相关研究。这些模型能够是细胞，也能够是完整动植物或微生物个体。最常见是小鼠。

基因敲除技术第17页②.提供廉价异种移植器官

众所周知，器官起源稀少往往是人体器官移植一大制约原因，而大量廉价异种生物如猪等器官却不能用于人体。这是因为异源生物基因会产生一些能引发人体强烈免疫排斥异源分子，假如能将产生这些异源分子基因敲除，那么动物器官将能用于人体疾病治疗，这将为患者带来具大福音。基因敲除技术第18页③疾病分子机理研究和疾病基因治疗

经过基因敲除技术能够确定特定基因性质以及研究它对机体影响。这不论是对了解疾病根源或者是寻找基因治疗靶目标都有重大意义。对于日益威胁人体健康肿瘤而言，它产生多是抑癌基因突变结果，所以，可应用基因敲除技术制备人类癌症鼠模型。同时，应用RNAi技术能够特异地杀伤带有异常基因肿瘤细胞。基因敲除技术还可用于治疗遗传病，包含去除多出基因或修饰改造原有异常基因以到达治疗目标。基因敲除技术第19页

④免疫学中应用

同异源器官移植相同，异源抗体用于人体时或多或少会有一定免疫排斥，使得人用抗体类药品生产和应用受阻。而假如将动物免疫分子基因敲除，换以人对应基因，那么