核酸分子杂交与应用

关于核酸分子杂交与应用15.04.2024115.04.20242核酸分子杂交：来源相同或不同的DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在合适的条件下通过碱基互补形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交(molecularhybridization)。核酸分子杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，也是临床分子检验的重要技术。第2页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20243第3页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20244核酸探针的标记探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的核酸片段。标记物放射性标记非放射性标记生物素标记地高辛标记荧光素标记第4页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20245探针的种类DNA探针：双链或单链DNA探针是最常用的核酸探针。长度在几百碱基对以上。DNA探针又分为：基因组DNA探针：有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。第5页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20246探针的种类DNA探针优点：1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖；2、DNA探针不易降解3、DNA的标记方法比较成熟。第6页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20247探针的种类RNA探针：可以是标记分离的RNA，也可以是重组质粒在RNA聚合酶作用下的转录产物。其优点是：RNA探针为单链，复杂性低，与靶序列杂交反应效率极高因不存在重复序列，因此特异性高本底低缺点：第7页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20248探针的种类寡核苷酸(oligo)探针：由17～50mer组成的短探针。优点：可根据需要人工合成相应的序列；因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值也有明显变化，特别适用于点突变的检测杂交速度快特异性强缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂交体不稳定第8页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20249探针的标记切口平移法标记原理：是目前实验室是最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。第9页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202410DNaseIDNAPolI,α-32P-dNTP第10页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202411第11页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202412标记步骤1、取1μgDNA溶于少量无菌蒸馏水中2、加入μl10x切口平移缓冲液，混匀

10x切口平移缓冲液

0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mol/LMgSO41mmol/L二硫苏糖醇(DTT)500μg/ml牛血清白蛋白第12页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202413标记步骤3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。

以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。第13页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202414标记步骤5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀6、加入0.5μl稀释的DNaseI溶液，混匀7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀注：以上操作均在冰浴中进行8、置14～16oC水浴中保温1～2小时9、加入2μl0.5mol/LEDTA终止反应10、纯化标记的DNA探针第14页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202415单链DNA探针的标记第15页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202416探针的标记随机引物法标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。第16页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202417第17页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202418标记步骤1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下列溶液，并混匀

20mmol/LDTT1μl5mmol/LdATP、dGTP、dTTP1μl10x随机引物缓冲液1μl

标记dCTP3μl

水1μl第18页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202419标记步骤2、取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中3、加入1μl(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混匀并离心，室温反应3小时以上第19页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202420标记步骤4、取10μl终止缓冲液，置－20oC保存备用终止缓冲液

50mmol/LTris.Cl(pH7.5)50mmol/LNaCl5mmol/LEDTA0.5%SDS第20页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202421随机引物标记法特点1、除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。2、标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上3、操作方便第21页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202422第22页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024233’末端标记末端标记属于部分标记。特点是可得到全长DNA片段，但标记活性不高。3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3’标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法T4DNA聚合酶标记法第23页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202424大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法：标记反应步骤：(1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀DNA1μg10xKlenow片段缓冲液2μl2mmol/L3种dNTP(无dATP)1μl[α-32P]dATP30μCi

加水至25μl10xKlenow片段缓冲液2μl0.5mol/LTris.Cl(pH7.2)0.1mmol/LMgSO4

1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)500μg牛血清白蛋白第24页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202425(2)加入1单位Klenow聚合酶片段，室温反应30min。(3)加入12μl0.5mol/LEDTA以终止反应。酚/氯仿抽提1次。(4)SephadexG－50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段末端标记法：第25页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202426注意事项：(1)要根据不同限制酶产生的不同粘性末端选择不同的标记核苷酸。(2)选择适当的限制酶及α-32P-dNTP,利用DNA聚合酶IKlenow片段的末端填充活性，可以选择性地将DNA双链之中一条链特异地标记。(3)此方法不能直接用于3’凸出末端DNA的标记。第26页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202427CCTAGGAATTCAATTCCCTAGGEcoRIBamHI加入DNA聚合酶，dNTP(其中一种为标记核苷酸)AATTCCCTAGG第27页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202428T4DNA聚合酶标记法T4DNA聚合酶具有两种功能，5’→3’聚合活性和3’→5’外切活性。当反应体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶主要表现为外切酶活性。利用这一特性可产生5’凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一为标记核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出标记探针。第28页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202429T4DNA聚合酶，无dNTP加入dNTP,其中一种为标记核苷酸第29页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202430标记反应步骤：(1)在反应管中加入下列试剂并混匀DNA0.2~0.5μg1xT4DNA聚合酶缓冲液2μl

加水至20μl(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育(3)加入适量T4DNA聚合酶。(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入

1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。(5)SephadexG－50柱层析或乙醇沉淀法分离标记的DNA片段。第30页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024315’末端标记标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使ATP分子上的γ磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5’－OH基团上。因此采用γ-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5’端标记。但核酸样品5’端必需是去磷酸的。第31页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202432PP磷酸酶T4多核苷酸激酶ATPPP第32页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202433标记反应步骤：(1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸酶(CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一个月以上。(2)将DNA样品溶解于少量10mmol/Ltris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：第33页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20243410xCIP缓冲液5μlCIP缓冲液适量

加水至48μl置37oC30分钟。加入第二份CIP，继续保温30分钟，即可脱去5’端磷酸基团。0.01U的CIP，可脱去1pmol5’磷酸基团(1.6μg4kb线性DNA的5’端数相当于1pmol)。10xCIP缓冲液Tris.Cl(pH9.0)10mmol/LMgCl21mmol/LZnCl210mmol/L亚精胺第34页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202435(3)加入40μlH2O，10μl10xSTE，5μl10％SDS。加热至68oC，15分钟。10xSTE

100mmol/LTris.Cl(pH8.0)1mol/LNaCl10mmol/LEDTA酚/氯仿及氯仿各抽提两次除CIP，SephadexG－50层析脱盐后乙醇沉淀。取脱盐后的脱5’磷酸DNA1～50pmol溶于少量水中，然后加入下列试剂进行5’末端标记：第35页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202436加水至50ul，混匀，37oC保温1小时。加入2ul0.5mol/LEDTAz终止反应，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG－50层析分离后得5’标记的DNA探针。γ-32P-ATP50pmol(150uCi)T4多核苷酸激酶10～20U10x激酶缓冲液10ul第36页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202437注意事项：(1)T4多核苷酸激酶对多种杂质非常敏感，要求必需达到一定的纯度；脱磷酸后要用SephadexG50层析除去小分子及离子。(2)亚精胺即可促进γ-32P-ATP的掺入，又能抑制核酸酶的活性

。(3)脱磷酸的DNA样品最好经电泳纯化以除去其中存在的低分子质量的核酸，否则会竞争性抑制目标DNA的标记

。第37页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202438探针的线纯化凝胶过滤柱层析法利用凝胶的分子筛效应，将标记的DNA与小分子彼此分开。因标记的探针量很小，一般用离心柱层析法。乙醇沉淀法第38页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202439核酸分子杂交的种类和方法核酸分子杂交的基本原理：DNA分子由两条互补的单链形成的双螺旋结构。维持结构稳定的力有三：1、两条链间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆积力(范德华力)；3、中和链内的负电荷。变性：在理化因素作用下，双螺旋结构间的氢键断裂，两条链解开形成单链的过程。第39页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202440第40页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202441变性温度(Tm)：核酸分子热变性时，从开始变性到变性结束，是在一个很窄的温度范围内进行的，当变性进行到核酸分子解链一半时的温度，称变性温度，也称融解温度。第41页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202442第42页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202443影响变性的因素：1、碱基组成DNA分子中G＋C含量越高Tm越高。在1×SSC溶液中，两者之间的关系可以用经验公式表示：Tm＝(G+C)%×0.41+69.3其中，69.3为无G＋C存在时的Tm值。(G+C)%每增加1％，Tm约上升0.41oC。第43页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202444影响变性的因素：2、溶液的离子强度DNA链骨架上的磷酸基团带有较多的负电荷，它们之间的静电相斥作用是其双链的不稳定因素之一。在无盐的水中，DNA在室温下就会变性，加入盐后，正离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA稳定性增加，Tm值升高。第44页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202445影响变性的因素：3、pH值pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。在高pH值下，可使碱基失去形成氢键的能力。当pH大于11.3时所有氢键均被破坏，DNA完全变性。4、变性剂可以干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常用50％的甲酰胺以使Tm值降低30oC

。第45页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202446复性：变性核酸分子在合适的条件下重新形成双螺旋结构的过程称复性。热变性的DNA溶液在低于Tm值25oC的温度下维持相当长的一段时间，则可使之恢复到天然的双链结构状态。复性的速度受以下因素影响：1、DNA浓度DNA浓度越大复性速度越快；2、DNA的分子质量大分子质量的DNA扩散速度慢，复性速度慢；第46页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024473、温度温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；4、离子强度5、DNA分子的复杂性DNA总量一定时，基因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数越少，互补顺序的浓度越低，复性反应速度越慢。第47页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202448分子杂交技术就是利用了核酸分子的变性与复性原理，使变性的核酸分子与检测核酸分子在碱基互补的条件下形成杂交双螺旋的过程。探针(probe)：在核酸变性实验中，为使杂交体与单链核酸分子区分开来所使用的带有标记的单链核酸分子。第48页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202449核酸分子杂交分类：以杂交分子分类：DNA与DNA杂交；DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。以探针标记分类：以杂交介质分类：液相杂交与固相杂交。固相杂交：菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及基因芯片等技术。第49页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202450液相杂交(solutionhybridization)：是一种比较原始的分子杂交技术。待测分子与探针在杂交液中完成反应，利用层析方法将杂交分子与末杂交分子分开后用液闪仪进行计数或利用紫外吸收特性变化分析杂交结果的分子杂交类型。液相杂交又分为：RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。第50页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202451RNA酶保护分析法(RPA)：利用RNaseA和RNaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA受到保护的特点，用体外转录合成的放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体，用RNase降解非杂交部分RNA后分析杂交结果。第51页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202452RNA酶保护分析法的应用：mRNA定量mRNA未端定位内含子在相应基因中的位置第52页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202453第53页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202454RNA酶保护分析法的主要步骤：1、制备待测RNA从细胞或组织中提取总RNA或mRNA；2、RNA探针标记采用体外转录的方法制备和标记探针；3、分子杂交：将待测样品RNA和RNA探针在液相中杂交，杂交前将样品和探针变性，破坏二级结构；4、RNA酶消化单链RNA；5、电泳分析杂交分子。第54页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202455核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay)：原理与RNA酶保护分析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地降解单链DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克隆和扩增特定基因的单链DNA片段，在合成过程中加入核素标记物，即可合成出高放射性的单链DNA探针。将探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA杂交双链。酶解后进行分析。第55页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202456核酸酶S1保护分析法可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。液相杂交的优点：设备简单、操作方便。液相杂交的缺点：过量未杂交探针难以除去，产生高背景；同源与异源核酸均可形成双螺旋结构使得杂交结果难以分析。第56页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202457固相杂交：将欲分析的样品先结合在固相支持物上，再与探针进行杂交反应。杂交结果可用仪器或放射自显影技术分析杂交结果。固相支持物的选择：可用于固相支持物的种类很多。一种良好的固相支持物应具备以下几个特性：第57页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024581、具有较强的结合核酸分子的能力；2、与核酸分子结合后不影响与探针的结合；3、与核酸分子的结合稳定牢固；4、非特异性吸附少；5、具有良好的机械性能便于操作。第58页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202459硝酸纤维素滤膜优点：具有较强的吸附单链DNA或RNA的能力，特别是在高盐浓度下，其结合能力可达80～100μg/cm2。吸附的单链核经真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而结合在硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜具有杂交信号本底低的特点广泛用于各种杂交实验。缺点：与单链核酸的结合能力不十分牢固，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜时(特别是在高温下)DNA会出现脱膜现象，硝酸纤维素膜质地较脆使操作不便。第59页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202460尼龙膜：是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，不同类型的膜上网孔大小不同。经正电荷基团修饰后与核酸的结合力更强。尼龙膜与核酸的结合能力为350～500

μg/cm2。经烘烤或紫外线照射后，特别是紫外线照射，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上带正电荷的基团相互交联，使结合更加牢固。第60页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202461Southern印迹杂交：第61页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202462第62页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202463第63页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202464第64页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202465Southern印迹杂交过程1、DNA样品的酶切和电泳2、电泳胶的处理3、DNA的转移4、DNA的固定5、DNA膜的杂交第65页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202466杂交过程1、预杂交：为了减少非特异性杂交反应，在杂交前应进行预杂交，将非特异性DNA位点封闭。常用的封闭物有两类：其一是变性的非特异性DNA，大多采用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封闭DNA上的非特异位点；封闭膜上与非特异性DNA结合位点。第66页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202467预杂交液的配制6×SSC（1×SSC为0.15mol/LNaCl和o.o15mol/L柠檬酸）5×Denhardt’s溶液0.5％SDS100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA50％甲酰胺(可不用)50×Denhardt：聚蔗糖(Ficoll400)5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(组分V)5g加水至500ml，分装后保存于－20oC第67页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.20246810mg/ml鲑鱼精DNA：超声法或用注射器通过6号针头反复抽打将DNA打断。煮沸后置－20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分钟后速置冰浴中。甲酰胺：使用前用DowexXG8混合床阴阳离子交换树脂处理1小时，小量分装后置－70oC保存。第68页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202469膜的处理：将结合了DNA(或RNA)的硝酸纤维素膜或尼龙膜浸泡于6×SSC溶液中2分钟，使其充分湿润。预杂交：将湿润的滤膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入预杂交液，尽量排除其中的气泡后用封口机封口。第69页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202470温育：将杂交袋浸入适当温度的恒温水浴中(不加甲酰胺时用68oC；加入50％甲酰胺时，恒温42oC)，温育1～2小时，也可延长至12～16小时。保温过程中应不断摇动塑料袋，以赶走盖在滤膜表面的气泡，否则这些气泡将阻碍杂交液与滤膜的接触。(如果将预杂交液加热到适当温度后再加入塑料袋内，可以减少气泡产生)。第70页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024712、杂交：杂交反应是单链核酸探针与待测核酸分子中的特异基因序列在一定的温度下杂交复性的过程。杂交包括以下过程：1、杂交液配制：同预杂交液2、探针变性：放射性标记的探针为双链时，于100oC加热5分钟变性并迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性第71页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.2024723、打开预杂交袋弃去预杂交液，加入杂交液及变性的探针。排除气泡后重新封好口4、在与预杂交相同温度下，保温8～16小时第72页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202473洗膜：是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从滤膜上洗去的过程，非特异性杂交体稳定性较低，解链温度较低，在一定温度下，非特异性杂交体解链而被洗掉，而特异性杂交体则保留在滤膜上。杂交体的解链温度主要取决于杂交体的同源性和溶液的离子强度两个要素，同源性越高离子强度越高，杂交体的稳定性越高。第73页,共85页，2024年2月25日，星期天15.04.202474洗膜的操作如下：1、杂交完毕，取出杂交袋，剪去一角，弃去所有的杂交液，取出膜并迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS溶液中，室温下不断振荡。注意不要使滤膜干燥。2、5分钟后，将滤膜转移至一盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温振荡15分钟。第74页,共85页，2024年2